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脱脂和脱蛋白处理对虫草多糖测定影响 　　摘要：以虫草发酵菌粉为材料，比较多糖提取过程脱脂、脱蛋白操作对硫酸-苯酚法和硫酸-蒽酮法测定多糖值的影响。研究结果表明，同一样品提取多糖时不脱脂和蛋白（A）、只脱脂（B）、只脱蛋白（C）、脱脂脱蛋白（D）对硫酸-蒽酮法与硫酸-苯酚法测定结果差异显著，2种比色法测得多糖含量值均呈现ABCD，其中脱蛋白的操作比脱脂操作对2种比色法测定结果影响更大。同时还显示，硫酸-苯酚法测得的多糖含量较硫酸-蒽酮法测得值大。并通过精密度、回收率、稳定性比较发现，硫酸-苯酚法优于硫酸-蒽酮法。 　　关键词：虫草多糖；脱脂；脱蛋白；含量测定；硫酸-苯酚法；硫酸-蒽酮法 　　中图分类号： R284.1文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2017）09-0144-03 　　测定多糖含量的方法主要有比色法、高效液相色谱法和酶法等，其中高效液相色谱法与酶法由于样品前处理工序比较繁琐，测定时间较长，检测费用较高等原因未能广泛使用，而比色法中的苯酚-硫酸法与蒽酮-硫酸法由于操作简单、实用性强，在多糖研究中被广泛使用[1]。比色法多糖含量测定包括提取和含量测定2部分，农业部标准食用菌中粗多糖含量的测定（硫酸-苯酚法）[2]及中国药典[3]灵芝多糖含量的测定（硫酸-蒽酮法）均为粗多糖的测定，前者是醇洗后水提，后者是水提后醇沉，均不脱脂不脱蛋白。现行的多糖提取处理与多糖测定的基本流程可归纳为：菌粉→脱脂（兼脱色）→水提→醇沉→脱蛋白→得精多糖液→显色反应→比色，实际研究中的具体操作各有不同，主要区别在于多糖提取是否经脱脂处理或是否经脱蛋白处理，包括不脱脂和蛋白[4-7]、只脱脂[8-9]和只脱蛋白处理等[10-13]。目前，采用2种比色法进行不同提取处理测定虫草多糖之间的差异还缺乏研究，因此，本研究以虫草菌粉为材料，在多糖提取过程中，通过脱脂和脱蛋白处理，用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法进行多糖的测定，研究脱脂和脱蛋白处理对虫草多糖测定结果的影响，为完善虫草多糖测定方法和虫草相关产品开发利用提供参考。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　试验材料：冬虫夏草菌来源于中国科学院微生物研究所，经5 L发酵罐发酵、过滤、烘干、粉碎研磨制得。 　　仪器：分光光度计UV1000，上海精科天美；离心机HC-3016，安徽中科中佳；索氏提取器GG-17 50/42，上海乔枫；旋转蒸发仪RE-52AA，上海亚荣；移液枪。 　　试剂：浓硫酸、苯酚、蒽酮、乙醚、氯仿、乙醇（均为分析纯）。 　　1.2试验设计 　　本试验共设4个处理，分别为A：不脱脂也不脱蛋白（对照）；B：脱脂；C：脱蛋白；D：既脱脂又脱蛋白。其中?理B依次包括：脱脂、水提、醇沉、定容和多糖测定；处理C依次包括：水提、醇沉、脱蛋白、定容和多糖测定；处理D依次包括：脱脂、水提、醇沉、脱蛋白、定容和多糖测定。 　　1.3样品处理和多糖提取 　　1.3.1脱脂称取1.00 g研磨后的菌粉，滤纸包裹于盛有 250 mL 乙醚的索氏提取器，42 ℃回流2 h，取出挥发干[7]。 　　1.3.2水提将菌粉置于三角瓶中，加水100 mL，95 ℃下浸提1 h，浸提2次合并，8 000 r/min离心10 min后，取上清液于55 ℃下旋转蒸发，浓缩至约50 mL[9]。 　　1.3.3醇沉将浓缩液加入3倍体积的95%乙醇，静置于 4 ℃ 冰箱中12 h。于8 000 r/min下离心10 min，取沉淀，再用无水乙醇洗涤后离心，取沉淀90 ℃热水复溶至50 mL[9]。 　　1.3.4脱蛋白将上述复溶的溶液置于分液漏斗，加入Sevage试剂（氯仿 ∶正丁醇体积比4 ∶1）15 mL，振荡后静置 5 min，弃下层有机相，重复5次，得多糖液[10]。 　　1.3.5定容将上述制备好的多糖溶液加蒸馏水定容至100 mL待测。 　　1.4多糖的测定 　　1.4.1硫酸-苯酚法[2] 　　1.4.1.1苯酚溶液的配制称取80 g苯酚溶于蒸馏水，定容至100 mL，于棕色瓶中4 ℃冰箱中避光保存备用；实际使用时现用现配5%的苯酚溶液。 　　1.4.1.2标准曲线的制备称取干燥葡萄糖0.010 g，溶于蒸馏水定容至100 mL；分别移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 葡萄糖液置于具塞试管中，加蒸馏水至2 mL，另取1支试管加入蒸馏水2 mL作为空白对照。将上述每一试管中分别加入苯酚溶液1 mL，加5 mL浓硫酸，静置10 min，涡旋振荡混匀，30 ℃反应20 min，于490 nm下测定吸光度。 　　1.4.1.3样液的测定取定容后的样液0.20 mL，加蒸馏水至2 mL，按照标准曲线制备项下的方法，自加入苯酚溶液起，测定吸光