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血管内皮生长因子对软骨细胞凋亡作用 　　[摘要] 目的 探讨血管内皮生长因子（VEGF）对软骨细胞凋亡的影响。 方法 乳鼠关节软骨细胞体外培养成功后，实验分为三组。每组加入不同处理因素进行干预，对照组：不加任何处理因素；VEGF组：VEGF 10 ng/mL；白介素（IL）-1β组： IL-1β 10 ng/mL，连续培养48 h。采用流式细胞仪检测软骨细胞的凋亡率，采用蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白的表达，通过硝酸还原酶法检测上清液中一氧化氮（NO）的含量。 结果 软骨细胞的凋亡率VEGF组[（9.28±2.35）%]及IL-1β组[（17.14±5.07）%]明显高于对照组[（2.83±0.77）%]；软骨细胞PCNA蛋白表达VEGF组（0.86±0.24）及C组（0.72±0.05）明显低于对照组（1.01±0.11）；软骨细胞分泌的NO含量VEGF组[（112.31±12.73）μmol/L]及IL-1β组[（150.02±15.34）μmol/L]显著高于对照组[（49.35±6.68）μmol/L]，差异均有高度统计学意义（P 0.01）。 结论 VEGF能够介导软骨细胞凋亡，抑制软骨细胞的增殖活性。 　　[关键词] 血管内皮生长因子；骨关节炎；软骨细胞；凋亡 　　[中图分类号] R684.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）12（a）-0004-04 　　骨关节炎（osteoarthritis，OA）是以关节软骨细胞凋亡和细胞外基质进行性降解为主要病理特征的疾病。OA的病因尚不完全清楚，研究证实OA受累软骨和滑膜中已发现多种血管生成介质，其中血管内皮生长子（vascular endothelia growth factor，VEGF）是血管生成的主要调节因子，探讨VEGF在关节软骨中退变的作用，特别是以VEGF为靶向的骨关节炎疾病的治疗是研究的热点之一。本实验探讨VEGF对软骨细胞凋亡，以及对增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表达和一氧化氮（nitric oxide，NO）含量的影响，为今后以VEGF为靶点治疗骨关节炎提供新思路。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 　　武汉大学医学部实验动物中心提供的出生1周龄的SD级乳鼠10只，雌雄不分，体重（100±10）g。DMEM/F12培养基（Gibco），胎牛血清（美国Hyclone公司），胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶（美国Sigma公司），细胞总蛋白提取试剂盒（武汉谷歌生物），PCNA一抗，Annexin-FITC细胞凋亡试剂盒，NO检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 软骨细胞的体外培养和分离 将乳鼠处死后，75%乙醇浸泡，取其膝关节软骨，并无菌条件下移至加有10%胎牛血清的培养基中，剪碎至1 mm3大小，依次用0.25%胰蛋白酶37℃消化40 min，1000 r/min离心5 min后，弃上清，用PBS洗3遍，再加入0.2%Ⅱ型胶原酶，37℃消化2 h，细胞接种于DMEM/F12培养基，并补充100 mL/L胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，密度为2×105接种于培养板，置于CO2培养箱中培养，待细胞70%～80%融合后，培养基中分别加入不同干预因素。实验分三组，对照组：不加任何处理因素；VEGF组：10 ng/mL VEGF；C组：10 ng/mL IL-1β，每组设4个复孔，连续培养48 h进行检测。 　　1.2.2 流式细胞技术检测软骨细胞凋亡 用0.25%胰酶将各组贴壁细胞从培养板上消化并分别收集至2 mL EP管中，将各组细胞用1 mL PBS洗涤一遍，最后各组分别加入5 μL Annexin-FITC、10 μL碘化丙啶，室温避光孵育15 min，上机检测，重复5次。 　　1.2.3 Western Blot法检测软骨细胞PCNA的表达 6孔板铺软骨细胞2×105孵育过夜，加入以上干预因素，24 h后，加入细胞裂解液100 μL裂解细胞，按常规的Western Blot操作方法进行，冰上裂解5 min，12 000 r/min离心5 min，取上清行BCA蛋白定量；取样品约10 μg行SDS电泳，将蛋白转到PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗（兔抗PCNA单克隆抗体，1∶1000），4℃过夜；PBS漂洗3次每次10 min，加入HRP标记羊抗兔二抗（1∶3000），室温孵育1 h，漂洗3次，用ECL显色液曝光，灰度扫描仪进行定量分析。 　　1.2.4 硝酸还原酶法检测软骨细胞分泌NO的含量 NO是一种广泛存