辛伐他汀对大鼠脂肪源性干细胞增殖和成骨分化影响.docVIP

辛伐他汀对大鼠脂肪源性干细胞增殖和成骨分化影响 　　摘要：目的 观察辛伐他汀对大鼠脂肪源性干细胞的增殖及骨代谢的影响。方法 采用胶原酶消化的方法，从大鼠腹股沟脂肪中分离出脂肪干细胞，贴壁法筛选纯化细胞并体外扩增。取第3代细胞，加入不同浓度的辛伐他汀（0μm，0.01μm，0.1μm，1μm，10μm，100μm）CCK-8检测各组的细胞增殖能力；使用RT-PCR检测相关骨向分化基因的表达；茜素红染色评价成骨诱导矿化的效果。结果 浓度低于1μm的辛伐他汀各组可促进脂肪源性干细胞增殖（P0.05），高于此浓度会对细胞产生剂量依赖性的抑制作用；辛伐他汀浓度低于1μm的各组对脂肪源性干细胞成骨诱导相关基因的表达以及成骨矿化诱导有显著的促进作用（P0.05）。结论 一定浓度的辛伐他汀对大鼠脂肪源性干细胞的增殖和成骨分化有促进作用。 　　关键词：辛伐他汀；脂肪源性干细胞；成骨诱导；增殖 　　辛伐他汀诱导骨髓间充质干细胞成骨诱导分化及增殖的作用已屡见报道，但其对脂肪源性干细胞的成骨分化是否有诱导作用还有待研究。本实验拟使用不同浓度梯度的辛伐他汀诱导大鼠脂肪源性干细胞成骨分化，旨在从体外细胞水平探索辛伐他汀对大鼠脂肪源性干细胞成骨诱导的最佳剂量。 　　1 资料与方法 　　1.1一般资料 　　1.1.1主要试剂 辛伐他汀（默沙东），I型胶原酶（Sigma），CCK-8（碧云天），RNAiso Plus（TAKARA）， PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TAKARA）， SYBR?R Premix Ex TaqTM II （TAKARA），茜素红S（Sigma），引物合成（上海introvigen），常规细胞培养器械。 　　1.1.2实验动物 清洁级雄性SD大鼠12只，4～6周龄，体重100～180g。常规手术器材，无菌手术间，动物手术台。 　　1.2方法 　　1.2.1 ADSCs的分离与纯化培养 将大鼠用0.6%戊巴比妥钠（0.5ml/100g）腹腔注射麻醉，双侧腹股沟去毛，消毒铺单，取腹股沟直切口，分离皮下脂肪，操作注意无菌原则。将约1.2g脂肪移入超净台，含2%双抗的PBS漂洗5遍，剔除结缔组织和血管，然后剪碎。PBS冲洗2编后，加入3倍体积的0.15%I型胶原酶，37℃恒温震荡（250rpm）消化60min，待消化液浑浊。白色液性脂肪漂浮于表层，残余组织沉淀于底层。加入等体积的含10%FBS的低糖DMEM培养基终止消化，吹打均匀，1500r/min，离心10min，弃去上层残余脂肪及上清。用含10%FBS+1%双抗的低糖DMEM培养基混悬细胞，70μm筛网过滤[1]。调整细胞浓度至1×105/ML，接种于25cm2培养瓶中，37℃，5%CO2孵箱中培养。48h后换液，清楚漂浮细胞，之后换液1次/3d。7～9d后细胞可生长至80%～90%融合，之后1：3传代。从第二代开始，消化后按每1×106个细胞每支冻存管的量冻存细胞，长期保存。 　　1.2.2辛伐他汀对ADSCs增殖的影响 取第3代细胞，以每孔1500个细胞接种于96孔板中，每孔100ul，待细胞贴壁生长后第2d，以不同浓度的辛伐他汀（0μm，0.01μm，0.1μm，1μm，10μm，100μm）加入常规培养基中，（每组n=5孔），分别于培养0h、24 h、48h、72h后每孔加入10ul cck-8，37℃避光孵育2h，终止培养，置酶标仪上测定波长450 nm处的吸光度值。实验重复3次。 　　1.2.3细胞总RNA的提取和荧光定量PCR检测ADSCs中成骨分化相关因子的表达 根据增殖实验的结果，减少了对增殖有抑制作用的高浓度辛伐他汀组，共设置5组：阳性对照组和阴性对照组，以及不同浓度的辛伐他汀组（0.01μm，0.1μm，1μm）。阳性对照组除加入常规培养基（低糖DMEM+10%FBS+1%双抗）外，还加入矿化诱导剂（100nM地塞米松+0.2nM维生素C+10mMβ-甘油磷酸钠），阴性对照组只加入常规培养基。细胞换液1次/d，培养14d后提取细胞总RNA，用微量核酸仪测定其浓度和纯度。取总RNA 600ng进行cDNA的合成，引物见表1。PCR扩增反应条件为：预变性95℃ 30s，94℃变性5s.退火60℃ 34s，40个循环，95℃终末延伸15s，59℃ 1min，95℃ 15s。反应体系为20ul。 　　1.2.4茜素红染色 按2×104cells/孔的细胞密度接种第三代ADSCs于24孔板中，每组3孔，共5组。分组同PCR检测。诱导14d后，洗去培养基，4%多聚甲醛固定10min，去除固定液，漂洗后加入茜素红染色液37℃染色20min，洗去残留染色液，镜下观察。然后再利用等量5%SDS-