锯末牛粪堆肥微生物多样性宏基因组学分析.docVIP

锯末牛粪堆肥微生物多样性宏基因组学分析 　　摘要：运用宏基因组技术研究不同比例锯末牛粪堆肥产物中微生物的组成和分布。结果表明，牛粪与锯末质量比为2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1的3个堆肥样本中微生物可操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）有较大的差异，其中含量最高的3个门的微生物为变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门，在不同样本中它们的含量也有较大差异。从属水平分析，含量最高的是甲基单胞菌属、噬氢菌属、固氮菌属和寡养单胞菌等营养转化和合成的菌属。降解纤维素和木质素的也有一定的含量，特别是假单胞菌属含量较高。经过对堆肥产物基本性质及其微生物的分析发现，当牛粪与锯末的比例为2 ∶1时，堆肥样品中的营养转化和合成菌属以及去除污染菌属都高于其他2个样品，堆肥效果较好。 　　关键词：牛粪堆肥；宏基因组；微生物；锯末；可操作分类单元（OUT）；分子生态学依据 　　中图分类号： S141.4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）07-0028-05 　　近年来，由于产业结构调整，我国规模化养殖业发展迅速。以生产牛奶为主的奶牛养殖业产生了可观的经济效益，但是同时也带来了大量的牛粪等固体有机废弃物，为了保护环境、实现养殖业的可持续发展，必须进行牛粪的无害化处理和资源化利用，堆肥处理是目前有机固体废物处理的重要方式。堆肥的本质是微生物群落结构演替协同作用于堆肥基质的生化过程[1-2]。在细菌和真菌等微生物的作用下，降解有机物，杀死病原菌，促进有机质稳定化和腐殖化，最终达到无害化和资源化的目的，并生成大量可被植物吸收利用的有效态氮、有效态磷、有效态钾化合物和其他有机物质作为土壤肥力活性物质。因此，研究微生物的群落结构对于了解微生物的协同关系、调控堆肥以及研究高效稳定的复合菌系都有重要意义。堆肥过程中的微生物菌系复杂，变化较大，而且其中大多数菌系不能分离培养，因而常规的试验方法和手段难以完全认识和真实反映微生物的群落组成[3-4]。宏基因学技术分析克服了传统微生物分析仅限于可分离培养组分的缺陷，通过对样品中微生物基因序列的分析，可以快速确定微生物的种类和丰度，主要采用16S rDNA序列分析进行微生物的群落分析检测出样品中大量的低丰度生物。目前，宏基因组学技术已经应用于海洋、土壤、石油以及人体胃肠道等多个方面[5-7]，但用于堆肥研究的较少。在牛粪堆肥中，通常以农作物秸秆、木质、锯末废弃物等作为辅料，起到加速堆肥过程和保证堆肥效果的作用[8]。本研究就地取材，在牛粪中添加不同比例的锯末，采用宏基因组学技术对不同比例锯末添加产生的微生物进行对比分析，旨在明确堆肥微生物的群落组成，合理评价堆肥效果，为堆肥工艺研究应用提供一定的分子生态学依据。 　　1材料与方法 　　1.1堆肥试验及样品采集 　　试验所用的牛粪和锯末分别从湖南省武汉市南湖养殖场和永宏木材加工厂收集（锯末作为调节剂）。堆肥试验在实验室内进行，以锯末为调理剂，与牛粪充分混合后进行堆肥试验，设置柱体高度为0.8 m，直径为0.5 m，实行人工翻堆通气，每3 d进行1次手工翻堆。在3个相同的堆肥容器内，将牛粪与锯末分别按照2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1比例混合，堆肥45 d时取样，分别在每个柱体的上、中、下采集样品，然后将3个取样点的样品混合为1个样品，3个堆肥容器所取的样品分别编号为1、2、3号样品。 　　1.2宏基因组DNA的提取和16S rDNA测序 　　对3个样本采用MIO-BIO的PowerSoil DNA Isolation Kit进行基因组DNA抽提，分别取3 μL进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。 　　根据illumina Miseq高通量测序要求，进行双向测序，设计16S V4～V5区域和带有5′Miseq接头-barcode-测序引物-特异引物-3′的融合引物。细菌16S V4～V5引物序列如下：515F，5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC- 　　NNNNNNNN-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTGC 　　CAGCMGCCGCGGTAA-3′；926R，5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-NNNNNNNN-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCACCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3′。文库构建采用2步PCR扩增的方法：首先采用特异引物扩增目的片段，将目的片段进行胶回收，而后将回收产物作为模板进行二次PCR扩增，目的是将illumina平台测序所需的接头、测序引物和barcode添加到目的片段的两端。将PCR扩增产物电泳检测效果好的样品于2%琼脂糖凝胶电泳切胶回收，取 3 μL 回收产物进行电泳检测。