银杏叶提取物对动脉粥样硬化过程中NFκB 表达作用及机制.docVIP

银杏叶提取物对动脉粥样硬化过程中NFκB 表达作用及机制 　　摘要：目的观察银杏叶提取物（GBE）对高胆固醇饲料喂养大鼠NFκB表达的影响，阐明其防治动脉粥样硬化的机制。方法SD大鼠24只随机分为高脂组、对照组、GBE低剂量组（80 mg/d）、GBE高剂量组（120 mg/d）。l2周后取血标本、主动脉标本，行组织形态学检查了解动脉粥样硬化情况，检测肿瘤坏死因子(TNFα)、白介素1（IL1）的含量及血管内膜细胞间黏附分子1(ICAM1)、核因子κB(NFκB)表达阳性率。结果GBE组的胆固醇（TC）、三酰甘油(TG)和低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）水平均低于高脂组(P＜0.05)，且GBE高剂量组TG、LDLC水平低于GBE低剂量组(P＜0.05)。高脂组的血管内皮细胞存在明显的崩解现象，可见斑块形成，而GBE组损伤轻微。与对照组比较，高脂组主动脉内膜ICAM1、NFκB表达阳性率、血清TNFα、IL1水平均显著升高，GBE组明显低于高脂组(P＜0.05)，且高剂量组优于低剂量组。结论GBE可以通过调节血脂、抑制NFκB表达，减轻动脉粥样斑块局部的炎症反应、保护血管内皮细胞而发挥防治动脉粥样硬化的作用。 　　关键词：动脉粥样硬化；银杏叶提取物；核因子κB 　　 中图分类号：R543.5R256.2文献标识码：Adoi:10.3969/j.issn2014.06.045文章编号2014 　　 　　动脉粥样硬化(AS)的发生机制甚为复杂，其中“损伤反应学说”现已为多数学者接受，并随着研究的深入不断得到充实和发展。核因子κB(NFκB)是参与机体免疫炎症反应的快速反应因子，在AS形成过程中，各种冠心病高危因素通过引起NFκB游离活化，导致炎症因子大量生成，而这些过度生成的炎症因子在动脉粥样斑块的形成中发挥了重要作用。中药银杏叶有敛肺、平喘、活血化瘀通络之功,用于冠心病心绞痛、高血压、脑梗死之瘀血阻络证候者。银杏叶提取物(GBE)含银杏黄酮苷、银杏内酯和白果内酯等多种活性物质。很多研究表明该药对缓解心绞痛症状、改善心肌缺血有良好疗效［1］，我们既往的研究还发现该药对模型大鼠有良好作用。为了进一步明确GBE防治动脉粥样硬化的机制，本实验观察了GBE对高脂模型大鼠NFκB以及相关炎性因子的影响。 　　1材料与方法 　　1.1动物健康SD大鼠24只，体重230 g～250 g，雌雄不拘，由中山大学动物实验中心提供。 　　1.2药物及试剂胆固醇和胆酸钠购于武汉亚法生物工程技术公司。银杏叶提取物由浙江康恩贝制药股份有限公司提供，商品名天保宁。用于检测肿瘤坏死因子(TNFα)、白介素1（IL1）的放射免疫分析试剂盒，由解放军总医院科技开发中心放免所提供。一抗NFκB p65，由北京中山生物技术有限公司提供；细胞间黏附分子1(ICAM1)由武汉博士德生物工程有限公司提供。 　　1.3动物分组随机分为4组，每组6只。对照组予以普通饮食；高脂组饲以高胆固醇饲料(由2％胆固醇、1％胆酸钠、10％炼猪油及87％普通饲料配制而成)，未用药干预；GBE组在饲以高胆固醇饲料的基础上按低剂量组80 mg/d、高剂量组120 mg/d给予GBE，蒸馏水稀释后灌胃。各组均自由进食，饮水不限，实验时间12周。 　　1.4血脂测定于12周末经心脏取血，用日本Olympus AU1000全自动生化分析仪测定血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)的浓度。 　　1.5病理组织学检查观察大鼠喂养12周后处死，开胸取靠近主动脉弓部的降主动脉，10%中性甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，HE染色，在光镜下观察血管内膜增生情况。 　　1.6免疫组化法检测NFκB、ICAM1蛋白表达石蜡切片5 μm，常规脱蜡至水，3%过氧化氢甲醇液室温浸泡10 min～15 min，消除内源性过氧化物酶活性。抗原修复2 min，用1%BSA封闭，室温10 min～15 min，倾去血清。滴加一抗(兔抗鼠多克隆，效价1∶50)，置于湿盒中4 ℃冰箱过夜，0.01 mol/L PBS振洗5 min共3次。滴加二抗pv6001/pv6002葡聚糖过氧化物酶复合物，37 ℃孵育60 min，0.01 mol/L PBS振洗5 min共3次。DAB显色5 min，蒸馏水洗5次。苏木素复染1 min，脱水、透明、中性树胶封片。光镜下观察结果，NFκB p65胞核染色呈棕黄色表示阳性。ICAM1阳性反应表现为胞浆呈现棕黄色颗粒。NFκB p65，ICAM1蛋白表达半定量计算机图像分析每组随机选取5例免疫组化切片，置显微镜下观察，每张切片选择阳性目标最多的区域，采取4个视野