银杏叶提取物对缺血再灌注肺损伤中血红素氧合酶影响研究.docVIP

银杏叶提取物对缺血再灌注肺损伤中血红素氧合酶影响研究 　　摘要：目的：研究分析银杏叶提取物对缺血再灌注肺损伤内血红素氧合酶的影响。方法：选择实验动物中心提供的60只健康小鼠，随机性平均分成四组，分别为对照组、I/R组、GBE组、ZnPP-IX组。结果：各组间H0-1活性相比，P0.05有统计学意义。GBE组MDA水平明显低于I/R组、ZnPP-IX组，差异P0.05有统计学意义。结论：银杏叶提取物能够诱导血红素氧合酶的表达，对I/R肺损伤具有良好的保护作用。 　　关键词：银杏叶提取物；缺血再灌注肺损伤；血红素氧合酶；影响 　　肺移植后一般会出现缺血再灌注（即为I/R）损伤，以至于肺损伤造成移植后早期肺功能障碍、受体死亡。研究发现[1]，血红素氧合酶1（简称HO-1）的高水平浓度是细胞拮抗氧化应激损伤的一项关键的内源性保护因子。银杏叶提取物（简称GBE）能够对细胞中的HO-1的表达进行诱导，促进HO-1的合成及分泌。现针对肺 II 型细胞 I/R损伤试验小鼠进行深入研究，观察GBE对细胞内HO-1的表达是否有所影响及对I/R肺损伤是否存在保护作用，研究如下。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　银杏特提取物（悦康药业集团有限公司，规格为5.0 ml：17.5 mg）。罗氏公司提供的COBAS 全自动生化分析仪，型号为INT EGRA400。H0-1免疫组化SABC试剂盒，由武汉博士德公司提供。其他试剂主要是分析纯。选择实验动物中心提供的60只小鼠，体重为18-23 g，平均（20.54±1.48）g。 　　1.2方法 　　1.2.1 A549细胞培养 　　A549细胞即为肺 II 型细胞株，对A549细胞进行复苏，然后在DMEM 培养基上完成接种，其中含有100 lug/ml的链霉素、100 U/ml的青霉素、10%浓度的胎牛血清。放置在37摄氏度、二氧化碳体积分数为5.0%、饱和湿度环境下进行培养，等到细胞贴壁后在第二天更换液体。当细胞铺满瓶底后[2]，应用PBS 进行冲洗，用0.25%浓度的胰蛋白酶进行消化，离心时收集细胞以便传代。 　　1.2.2制备肺 II 型细胞 I/R 模型 　　将A549细胞加入到甲右旋糖酐溶液（简称LPDG）内，放置在40 C、100% O2的封闭箱内培养12小时，模拟肺缺血。再更换成含有10%浓度的胎牛血清的DMEM，放置在37摄氏度、二氧化碳浓度为5.0%的培养箱内培养2小时，然后模拟再灌注[3]。 　　1.3实验分组 　　I/R组：A549细胞模拟缺血16小时，再灌注2小时。GBE组：应用GBE预处理24小时候，缺血12小时，再灌注2小时。ZnPP-IX组：应用GBE、Znpp-IX预处理24小时，缺血12小时，再灌注2小时。对照组：A549细胞进行常规培养。 　　1.4细胞损伤指标检查 　　1.4.1检查细胞存活率 　　在培养瓶中应用胰蛋白酶对肺 II 型细胞进行消化，溶入0.5%浓度的台盼兰，3分钟后，认真计算蓝染、没有蓝染的细胞计数，得出细胞存活率。 　　1.4.2检查线粒体呼吸能力（英简MR） 　　检查前，先把每组培养液更换成含有5.0%浓度的胎牛血清DMEM，再加入 hanK 液对四氮甲基唑蓝（简称MTT）进行溶解，最终浓度为0.5 mg/ml，放在37摄氏度环境中孵育1小时。认真吸弃培养液，滴入100 ul的二甲基亚砜（简称DMSO），轻慢摇动混匀培养液，应用450 nm的波长检查其吸光度。对照组吸光度100%作为标准，计算其余三组吸光度的百分比情况，以此表示细胞线粒体呼吸的能力。 　　1.4.3细胞上清液 MDA水平 　　在低温状态下离心培养液，每分钟1000 r，离心5分钟，吸取上清液，MDA 水平应用硫代巴比妥酸比色法进行检测[4]。 　　1.4.4凋亡的检查 　　收集2.0×106个肺 II 型细胞，进行离心沉淀，应用3.0%浓度的戊二醛进行固定，然后通过电镜检测。同时，收集1.0×106个细胞，应用PBS冲洗两次，通过碘化丙啶（简称P1）与FITC-Annexin V双染色后，使用流式细胞术凋亡率。 　　1.4.5 H0-1活性检查 　　细胞经5体积冷 TRis/Hcl 缓冲液进行离心，离心处理2次，分别是3.5 kg，20分钟；0.8 kg，10分钟，使线粒体沉淀。对上清液进行再次离心（105kg，90分钟），致使微粒体分离。应用100 mmol/L浓度、PH值7.4 的焦磷酸钠将血红蛋白除去，将磷酸钾缓冲液制备成微粒体悬液。 　　1.5统计学分析 　　通过SPSS 17.0 统计学软件对数据进行对比分析，对于计量资料，应用方差±表示，并使用配对样本t进行检验；对于计数资料，则用百分比（%）表示，然后利用X2进行