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龙葵内生细菌分离鉴定和多样性研究 　　摘要：采用16 S rDNA PCR-RFLP和16 S rDNA基因全序列分析的方法，对从龙葵植株中分离得到的37株内生细菌进行多相分类和系统发育研究，结果显示共有18种16 S rDNA基因型，在系统分类上归属于8个属，分别为短杆菌属（Brevibacterium）、芽孢杆菌属（Bacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、土壤杆菌属（Agrobacterium）、短波单胞菌属（Brevundimonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）和鞘脂杆菌属（Sphingobacterium）。其中，菌株S-30与模式菌株Brevibacterium frigorito-lerans DSM8801T 的相似度仅为94.9%，是一个潜在的新种。试验结果揭示了龙葵根、茎、叶组织中内生细菌的多样性及其系统发育地位。 　　关键词：龙葵；内生细菌；多样性； 16 S rDNA PCR-RFLP；系统发育 　　中图分类号：S182 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）18-4382-03 　　龙葵隶属茄科（Solanaceae）茄属（Solanum），又称野葡萄、天茄子、黑星星、苦菜、苦葵等，广泛分布于欧洲、亚洲、美洲的温带至热带地区[1]。中国龙葵有3个种和1个变种，分别为龙葵（S. nigrum）、少花龙葵（S. paucifloum）、红果龙葵（S. alatum）和黄果龙葵（S. nigrum var. flavovirns）[2，3]。龙葵为重要的药用植物，具有清热解毒、活血、利尿、消肿等功能，其化学成分、药理作用、临床应用等研究越来越受到重视，现已发现龙葵具有较多药理活性，包括抑制癌变作用等[4，5]。 　　内生菌在植物健康组织内普遍存在，包括真菌、细菌、放线菌等，但不会引起植物组织出现明显侵染症状[6，7]。内生细菌能够独立产生丰富的次生代谢产物，是天然药用代谢产物的重要潜在来源[8-11]，还可以通过自身的代谢产物并借助信号转导作用影响植物的生长[8]。药用植物内生细菌的研究对于药用植物的栽培、药性、药理作用和新药的开发研究具有很重要的意义。 　　目前对龙葵的研究主要集中在植株本身化学成分的检测、分离、药理作用和临床应用等方面，而对该类植物内生细菌分离、鉴定和多样性的研究未见报道。为此，对龙葵的内生细菌进行分离鉴定和遗传多样性分析，为进一步研究龙葵活性物质提供菌种资源，也为探讨内生菌与龙葵植株之间的关系及其栽培技术的改进提供依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 龙葵样品采集及内生菌分离 　　采集西北农林科技大学中草药苗圃新鲜龙葵植株，先将其根、茎、叶切成长约0.5 cm的小段，置于干净的培养皿中，经过5%次氯酸钠和70%乙醇表面消毒，果实消毒后压碎，接种于牛肉膏培养基上（牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，琼脂20 g，自来水1 000 mL，NaCl 5 g，pH 7.0～7.2），倒置于培养箱中，28 ℃培养3 d，待平板中长出菌落，纯化菌落3～4次，镜检以保证所得为纯培养，然后斜面培养保存[12，13]。 　　1.2 16 S rDNA PCR-RFLP分析 　　1.2.1 总DNA的提取 供试菌株经活化后接种于TY培养液中，28 ℃ 150 r/min振荡培养至对数中期，8 000 r/min离心收集菌体，用TE（10 mmol/L Tris、1 mmol/L EDTA，pH 8.0）洗涤3次，溶菌酶破壁，蛋白酶处理，酚+氯仿+异戊醇抽提，乙醇沉淀，风干，最后溶于双蒸水中。用琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白吸光法检测DNA样品的浓度和纯度[14]。 　　1.2.2 PCR扩增 以总DNA为模板，选用来源于E. coli 16 S rDNA基因序列保守区域的两段引物P1和P6配制成10 μmol/L浓度。正向引物P1：5′-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAAC 　　GCT-3′；反向引物P6：5′-CGGGATCCTACGGCTAC 　　CTTGTTACGACTTCACCCC-3′。分别对应于E. coli的第8～37碱基位置和第1 479～1 506碱基位置。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共33个循环，最后72 ℃延伸6 min，PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，-20 ℃保存[14]。 　　1.2.3 PCR-RFLP分析 10 μL 16 S rDNA PCR产物分别加入4种限制性内切酶（HaeⅢ、HinfⅠ、MspⅠ和HhaⅠ），37 ℃酶切