鲤鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂活性初步研究.docVIP

鲤鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂活性初步研究 　　摘要：利用凝胶层析法从鲤鱼（Cyprinus carpio）卵中分离纯化得到一种丝氨酸蛋白酶抑制剂。选择胰蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶及其特异底物，建立比色法检测，对初步分离的丝氨酸蛋白酶抑制剂活性进行了分析。结果表明，丝氨酸蛋白酶抑制除对胰凝乳蛋白酶无抑制作用外，对其他的蛋白酶均有抑制效果；当温度超过70 ℃时，丝氨酸蛋白酶抑制剂失活，但在pH 2～11均保持活性，具有较强的酸碱稳定性。 　　关键词：丝氨酸蛋白酶抑制剂；比色法；酸碱稳定性 　　中图分类号：S917.4；TS254.9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）18-4556-04 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.041 　　蛋白酶抑制剂（Proteinase inhibitor，PI） 泛指对蛋白水解酶具有抑制活性的蛋白质，由于其分子量相对较小，广泛存在于植物、动物和微生物中[1，2]。其中丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serine protease inhibitory，SPI）首先在动物血清中被发现[3]，蛋白酶抑制剂因子的活性中心可与蛋白酶结合形成稳定的复合体从而发挥作用，防止不必要的蛋白酶水解。它们在调节蛋白酶活性及机体免疫调控方面发挥重要的功能，如纤维蛋白溶解作用、血淋巴凝结，细胞活素类、肿瘤调控机制及激素的转运[4，5]。 　　中国淡水鱼产业发展迅速，动物蛋白资源仍有待开发[6]。目前，已有大量的报道针对鱼类的下脚料如鱼鳞中提取胶原蛋白和明胶[7]、鱼内脏中提取消化蛋白酶[8]和鱼脑中提取磷脂[9]进行研究。然而对于鱼卵的研究涉及较少，本试验从鲤鱼卵中分离纯化出丝氨酸蛋白酶抑制剂，并对其酶动力学性质进行初步研究，旨在为淡水鱼和该蛋白酶抑制剂的开发利用提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料与仪器 　　鲤鱼（Cyprinus carpio） 购于农贸市场，体长20～30 cm，体重0.3～0.5 kg，为性成熟雌体；胰蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及凝血酶均购自Sigma公司，发色底物Nα-Benzoyl-L-arginine 4-nitroanilide hydrochloride （B3133）、N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-pNA（S4760）、N-CBZ-Gly-Gly-Leu-pNA （C3022）、N-Benzoyl-L-tyrosine ethyl ester（BTEE）、N-（p-Tosyl）-Gly-Pro-Arg pNA （T1637）均购自Sigma公司，其他试剂均为分析纯，符合试验要求。 　　主要仪器：pH计、SephadexG50层析柱（2.6 cm×100 cm）、TU-1901 紫外可见分光光度计、高速冷冻离心机、LGJ-10冷冻干燥机、酶标仪。 　　1.2 方法 　　1.2.1 蛋白酶抑制剂的提取与纯化 从新鲜鲤鱼腹腔中取出鱼卵，蒸馏水洗净后加适量的纯水，按1∶1（m∶V）的比例用研钵研磨至匀浆，离心30 min（10 000 r/min，4 ℃），收集上清液，重复3次，合并上清液，冷冻干燥备用。将冻干粉溶解于适量的pH 6.0的0.1 mol/L磷酸氢盐缓冲液溶液中，10 000 r/min，4 ℃离心30 min，取上清液利用0.22 μm的滤膜过滤后加样至SephadexG50层析柱（2.6 cm×100 cm）中，用pH 6.0的0.1 mol/L磷酸氢盐缓冲液溶液（PBS）洗脱，流速为3.0 mL/min，收集活性组分，将收集的活性蛋白组分处理后加样至SephadexG75层析柱（2.6 cm×100 cm）中，用0.1 mol/L PBS洗脱，收集其活性成分，冷冻干燥备用。 　　通过微量样本多指标流式蛋白定量技术（BCA）试剂盒法测定蛋白质的含量，以牛血清为标准品，酶标仪法在562 nm处测定收集样品的吸光度。 　　1.2.2 蛋白酶抑制剂检测及胰蛋白酶抑制常数的测定 在pH 7.8含有1 mmol/L CaCl2的50 mmol/L Tris-Hcl缓冲液反应体系中，测定待测样品于25 ℃对丝氨酸蛋白酶家族的胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶水解生色底物的抑制影响。对枯草杆菌蛋白酶水解生色底物的抑制影响于pH 8.45含有1 mmol/L CaCl2的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液反应体系中进行。将不同含量的待测样品（终浓度2.5～50 mg/mL）与蛋白酶（胰蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶浓度均为2 mg/mL，凝血酶浓度为100 U/mL）于25 ℃保温15