黏着斑激酶相关非激酶在瘢痕疙瘩组织中表达及意义.docVIP

黏着斑激酶相关非激酶在瘢痕疙瘩组织中表达及意义 　　[摘要]目的：探讨黏着斑激酶相关非激酶（facol adhesion kinase-ralated nonkinase，FRNK）在瘢痕疙瘩组织中的表达及意义。方法：利用Western-blot及反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-PCR，RT-PCR）检测10例瘢痕疙瘩及10例相应周围正常皮肤组织中FRNK蛋白及mRNA表达水平并进行统计学分析。结果：瘢痕疙瘩组织中的FRNK蛋白表达明显低于正常皮肤（0.12±0.06比0.32±0.04），差异有统计学意义（P0.01）；瘢痕疙瘩组织中FRNK mRNA表达明显低于正常皮肤（0.27±0.03比1.10±0.05），差异有统计学意义（P0.01）。结论：FRNK蛋白及mRNA在瘢痕疙瘩组织中低表达，导致其对成纤维细胞凋亡作用减弱，对瘢痕疙瘩的形成可能起重要作用，通过调节FRNK的表达，有望为瘢痕的治疗提供新的靶点。 　　[关键词]黏着斑激酶相关非激酶（FRNK）；瘢痕疙瘩；成纤维细胞；凋亡 　　[中图分类号]R619+.6 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2016）04-0038-03 　　瘢痕疙瘩的病理生理特点是大量的成纤维细胞（fibroblasts，FBs）增生并伴凋亡障碍，氨基多糖和胶原在细胞外基质（extracelluar matrix，ECM）中过度异常沉积，胶原纤维排列紊乱。FBs是瘢痕疙瘩形成的效应细胞，也是胶原的主要来源，多种细胞因子、信号转导通路及基因如Fas基因、转化生长因子-β（transforming growthfactor-β，TGF-β）、类胰岛素一号增长因子等通过调节FBs代谢、转化、增殖、凋亡来促进瘢痕形成。黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）是一种位于胞浆中的非受体酪氨酸蛋白激酶，处于整合素、生长因子等多条信号转导通路之间的交汇点，在介导细胞粘附、迁移、侵袭及增殖等过程中起着重要的作用，而且FAK的主要磷酸化部位，对调节FAK的活性起关键作用。黏着斑激酶相关非激酶（facol adhesio-n kinase-ralated nonkinase，FRNK）是FAK单独表达的c末端结构域，但由于其缺乏FAK的激酶区，可以内源性的抑制FAK活性，FRNK同时可以负向调节黏着斑信号转导通路，达到抑制FAK的酪氨酸磷酸化的目的。近年来随着对瘢痕的深入研究，已经明确多种因素影响瘢痕的形成和发展，但目前尚未有明确关于FRNK与瘢痕疙瘩关系的研究。笔者采用反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-PCR，RT-PCR）和Western blot，分别从mRNA和蛋白水平检测FRNK在瘢痕疙瘩中的表达，探讨其在瘢痕疙瘩形成中的作用，为瘢痕的防治提供一定的实验依据。 　　1材料和方法 　　1.1标本来源 　　选用2013年7月2014年10月福建医科大学附属第二医院整形外科手术切除的瘢痕疙瘩及周围正常皮肤，取材部位为面部、胸背部、腹部或四肢等。由于受标本例数限制，瘢痕疙瘩10例，其中，男4例，女6例，年龄2～55岁，平均（30.00±18.83）岁，病程6～24月，平均（13.70±6.31）月，病因：外伤4例，手术3例，穿耳孔1例，感染2例。各标本要求：所取标本之患者无合并皮肤疾病、结缔组织病和其它重要脏器器质性疾病，局部皮肤无溃疡及感染；所有标本患者术前均未行放化疗、激光及免疫治疗，并经过患者同意切取；所有标本均经病理证实。 　　1.2主要试剂和仪器 　　兔抗FRNK多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，DNA凝胶回收试剂盒购自TIANGEN公司，RNA提取试剂Trizol购自日本TAKARA公司，RT-PCR试剂购自德国DBI公司，DEPC及逆转录试剂盒购自美国Sigma公司，RNasin购自美国Promega公司，HRP Goat anti-Rabbit IgG购自BOSTER，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自PierceTM，Annexin V/PIapoptosis kit购自杭州联科生物公司，裂解液购自碧云天公司，ABl9700PCR扩增仪、ABl310型DNA测序仪购自美国ABI公司，Stratagene Mx3000P Real time PCR仪购自美国Agilent公司。 　　1.3 Western Blotting检测 　　应用Western blot检测10例瘢痕疙瘩及10例相应周围正常皮肤组织中FRNK蛋白的表达。每例标本取3g，将组织剪切成细小的碎片（组织直径1mm）。按照每20mg组织加入150 u l裂解液的比例加入裂解液。用玻璃匀浆器匀浆，直至