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黄瓜缺铜响应转录因子CsSPL7克隆及表达分析 　　摘要：结合黄瓜基因组数据和生物信息学分析，采用同源扩增技术从黄瓜津研4号叶片中获得1个受缺铜诱导表达的基因，命名为CsSPL7。该基因全长1 746 bp，编码582个氨基酸，与拟南芥SPL7基因序列相似性为43%。QRT-PCR表达分析表明，CsSPL7是1个受缺铜诱导表达的基因，在缺铜处理的黄瓜叶片中表达量最高，并且随着铜处理浓度的升高，其表达量逐渐降低。研究结果为下一步分析CsSPL7在黄瓜缺铜胁迫过程中的功能奠定了基础。 　　关键词：CsSPL7基因；黄瓜；铜；QRT-PCR；同源克隆 　　中图分类号： S642.201文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）12-0088-03 　　收稿日期：2015-10-19 　　基金项目：黑龙江省青年科学基金（编号：QC2010089）。 　　作者简介：杜亚琳（1980―），女，河南郾城人，硕士，实验师，研究方向为园艺作物生物技术。E-mail：duyalin123@163.com。 　　铜（Cu）是植物生长和发育必需的微量元素，许多代谢过程，例如光合作用、线粒体电子传递、呼吸作用、活性氧代谢、细胞壁结构改变以及乙烯反应等，均需要铜作为辅助因子[1-2]。由于铜在发育过程中的重要意义，铜动态平衡在植物体内处于一种精细调控的状态。植物体内的铜浓度在不同物种以及不同外源铜环境条件下存在一定差异[3]。 　　目前，人们通过对植物铜缺失突变体的研究，已经初步明确植物对铜的吸收和积累机制。缺铜胁迫条件下，植物通过调控铜吸收和转运已经获得了精细调控体内铜动态平衡的机制[4-5]。例如拟南芥通过提高铜的吸收和获取量来应对缺铜胁迫。缺铜胁迫会上调拟南芥铜转运蛋白基因的表达，如ZIP2、ZIP4、FRO3等[6-7]。此外，缺铜胁迫时，在转铜伴侣CCH基因作用下，衰老过程中铜会在各组织间重新分配[8]。此外，研究表明，拟南芥SPL7是植物缺铜反应过程中的一个核心调控因子，在低铜条件下，铜转运蛋白基因（COPT1、COPT2、ZIP2、YSL2）、转铜伴侣基因（CCH、CCS）、FRO3、FRO4、FRO5和FSD1在spl7突变体中也均调控失衡[9-10]。此外，一些新鉴定出的缺铜响应蛋白同样受到SPL7的调控[10]。上述有关植物吸收和积累铜机制研究，暗示SPL7在植物响应缺铜胁迫过程中的重要调控作用，为深入研究农作物（如黄瓜）铜胁迫的生理与分子机制鉴定了基础。 　　黄瓜为一种重要的蔬菜作物，在世界范围内广泛栽培。随着工业、农业对含重金属材料的使用，以及排放的化学物质种类、数量的增加，重金属（如铜）污染的土壤面积日益扩大，使环境污染日益严重，造成农作物产量和品质下降、优良品种退化迅速，从而制约农业的发展，进而会威胁生态安全，影响农产品的品质，并通过食物链危及人类健康。尽管人们对植物缺铜响应机制的相关研究取得了较大进展，但是目前人们仍不能清晰阐述铜胁迫条件下植物（如黄瓜）调控铜动态平衡的生理与分子机制。通过基因工程改造植物基因培育高生物产量的重金属超积累植物是一个可行的途径，要实现这一目标，首先要明确植物对铜的吸收积累机制。因此，探讨黄瓜耐铜胁迫生理与分子机制具有重要的理论和实践意义。本研究拟克隆黄瓜CsSPL7基因，并对其序列和在缺铜胁迫条件下的表达模式进行分析，从而为后续利用基因工程技术研究该基因的功能及培育耐铜胁迫的黄瓜新品种奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　试验材料为黄瓜津研4号，购自天津科润黄瓜研究所。2015年春季在东北农业大学园艺实验站人工气候室内常规种植。在苗期，分别取同一植株的叶片（最顶部幼嫩叶片），用液氮冷冻并于-80 ℃保存，用于RNA的提取。 　　1.2铜处理 　　黄瓜植株采用水培方式进行栽培。采用MGRL营养液配方[含1.512 mmol/L NaH2PO4?2H2O、0.257 mmol/L Na2HPO4?12H2O、1.5 mmol/L MgSO4?7H2O、2.0 mmol/L Ca（NO3）4?4H2O、3.0 mmol/L KNO3，67 μmol/L Na2EDTA?2H2O、8.6 μmol/L FeSO4?7H2O、10.3 μmol/L MnSO4、1.0 μmol/L ZnSO4.7H2O、30 μmol/L H3BO3、24 nmol/L（NH4）6Mo7O24?4H2O、130 nmol/L CoCl2?6H2O]，分别添加不同浓度的CuSO4（0、1、5、25、50 μmol/L）进行处理，3 d更换1次营养液。 　　1.3总RNA的提取及单链cDNA反转录 　　总RNA的提取采用TRIzol（Invitrogen