黄芪注射液对糖尿病非酒精性脂肪肝模型大鼠血糖血脂及肝脏脂肪分化相关蛋白表达水平影响.docVIP

黄芪注射液对糖尿病非酒精性脂肪肝模型大鼠血糖血脂及肝脏脂肪分化相关蛋白表达水平影响 　　摘要：目的 研究黄芪注射液对糖尿病非酒精性脂肪肝模型大鼠血糖、血脂及肝脏脂肪分化相关蛋白表达水平的影响。方法 采用高糖高脂结合链脲佐菌素诱导Wistar大鼠糖尿病非酒精性脂肪肝模型；将大鼠随机分为对照组、模型组及黄芪注射液干预组，分别于实验8周、12周及16周检测大鼠血清血糖、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）的表达水平；HE切片观察大鼠肝脏病理形态的改变；免疫印迹（western-blot）检测大鼠肝脏脂肪分化相关蛋白（ADRP）的表达水平。结果 高糖高脂结合链脲佐菌素大鼠血糖、TG、TC增高，肝脏脂肪发生变性，糖尿病非酒精性脂肪肝模型构建成功。实验12周，干预组大鼠血清血糖、TG、TC水平均低于模型组，但差异无统计学意义（P0.05），肝脏脂肪变性程度与模型组大鼠基本相当，炎细胞浸润程度较模型组程度轻；实验16周，干预组大鼠血清血糖及TG水平明显低于模型组，差异有统计学意义（P0.05），肝脂肪变性程度较模型组明显减轻，炎细胞浸润基本消失；与正常对照组相比，NAFLD大鼠肝脏ADRP水平显著增高（P0.05），通过黄芪注射液治疗后，NAFLD模型肝脏ADRP的表达水平下调。结论 黄芪注射液可改善NAFLD大鼠血糖血脂代谢紊乱，减轻肝脏的炎症反应和变性，具有一定的肝脏保护作用。 　　关键词：糖尿病；非酒精性脂肪肝；黄芪注射液；脂肪分化相关蛋白 　　中图分类号：R587.1 R256.2 文献标识码：A 　　doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2014.04.042 　　文章编号：1672-1349（2014）04-0464-02 　　非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种以肝细胞脂肪变性为主，与酒精性肝病类似而无过量饮酒史的临床病理综合征。2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者由于肥胖、高脂血症等因素，因而更易发生NAFLD[1]。黄芪为中药益气药，有补益脾肺，益气补阳之功效，已广泛用于临床。据报道，黄芪可使高脂血症小鼠血清三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）水平降低，还具有抗脂质过氧化、抗氧自由基等作用[2，3]。本研究旨在观察黄芪注射液对糖尿病合并NAFLD大鼠血糖、血脂、肝脏形态学???化及脂肪分化相关蛋白的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物模型制备 雄性清洁级Wistar大鼠48只，体质量180 g～200 g，购自山西医科大学实验动物中心，实验经伦理委员会审查通过。将Wistar大鼠随机选择16只作为正常对照组，喂以普通饲料，其余30只用于制备糖尿病非酒精性脂肪肝模型，饲养环境控制在22 ℃～25 ℃。造模方法：高糖高脂饲料饲养（普通饲料66.5%、蔗糖20%、猪油10%、胆固醇2.5%、胆酸盐1%）。饲养4周后以50 mg/kg的剂量一次性腹腔注射链脲佐菌素，继续高糖高脂饲料喂养4周。空腹尾静脉采血测空腹血糖（FBG），以3次FBG11.1 mmol/L作为成模标准。将32只造模成功大鼠随机选择16只作为干预组，余16只作为模型组。干预组大鼠每日给予黄芪注射液3 mL/kg腹腔注射，对照组及模型组给予同体积生理盐水。 　　1.2 标本采集及检测 于干预后4周、8周（实验12周、16周）分批颈椎脱臼处死大鼠，心脏采血6 mL～8 mL，放于消毒干燥的EP管中，待血液凝固后1 000 r/min离心15 min，分离血清，-20 ℃保存待检。取大鼠肝脏右叶中部标本，一份置于-80 ℃冰箱保存，一份置于10%甲醛溶液中固定。血糖测定采用葡萄糖氧化酶法。血TG、TC采用全自动生化分析仪检测，试剂盒购自北京中杉试剂公司。 　　1.3 肝脏HE染色标本制备 梯度浓度的乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，制成厚度为3 μm切片，行苏木素-伊红染色，中性树胶封片。 　　1.4 免疫印迹检测肝脏ADRP的表达水平 称取肝脏组织各0.1 g，按1∶1比例加入组织裂解液，4 ℃离心机，10 000 r/min，离心10 min，取上清，紫外分光光度计上测OD值，计算蛋白含量。配制8%和5%SDS-聚丙烯酰胺分离胶和浓缩胶，电泳槽中加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液，60 V预电泳40 min，100 V电泳1 h。湿转膜法将蛋白转至NC膜上，设定参数100 V、350 mA转膜30 min。蛋白干粉封闭，按照1∶1 000浓度稀释ADRP一抗（santa cruz，sc-32888），将膜置于其中，4 ℃冰箱过夜，TBST缓冲液洗膜3次后置于二抗中室温轻摇反应1 h，TBST洗膜3次，ECL发光液