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黄鳝醛酮还原酶羰基解毒作用初探 　　摘要：醛酮还原酶（aldo-keto reductase，AKR）是机体依赖NAD（P）H的一类重要的氧化还原酶，在细胞有毒羰基化合物代谢中具有重要作用。迄今为止，国内外尚无鱼类醛酮还原酶基因及其功能的报道。为了解鱼类醛酮还原酶在细胞抗有毒羰基化合物胁迫过程中的作用，笔者比较了含重组黄鳝AKR基因的阳性菌株和不含该重组基因的阴性对照在丙酮醛及2，3-丁二酮2种羰基化合物处理后的存活率。结果表明，随着毒性物质处理时间的延长和处理浓度的升高，阳性菌株和对照菌株存活率均呈逐渐下降趋势；阳性菌株的存活率始终极显著高于对照菌株（P0.01）。结果提示，黄鳝的醛酮还原酶具有一定的羰基解毒作用。该研究为进一步深入了解鱼类AKR基因的功能提供了基础资料。 　　关键词：黄鳝；醛酮还原酶；羰基胁迫；存活率；解毒作用 　　中图分类号：S941.91 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0150-03 　　醛酮还原酶（aldo-keto reductase，AKRs）超家族是一类广泛存在依赖于NAD（P）H的氧化还原酶[1]。生物体内氧化应激[2]、致癌化合物降解[3]、糖尿病并?l症及肿瘤发生[4]等过程都有AKRs的参与。细胞内存在低浓度的羰基化合物如不能被及时降解，就会通过羰基化修饰使细胞内的蛋白质、核酸等生物大分子发生构象变化和功能丧失，并最终导致细胞代谢紊乱，引起癌变或坏死，这就是所谓的“羰基胁迫”[5]。醛酮还原酶可以将对细胞毒害较强的羰基化合物还原成相应的对细胞毒害作用较小或无毒性的醇类物质，承担机体防护酶的作用[6]。研究表明，大肠杆菌[7]及蓝藻[8]的AKR基因产物可有效降解丙酮醛、甘油醛等羰基化合物对细胞的毒害作用。植物的AKRs分子参与植物各种各样的逆境胁迫反应，是植物防御系统中不可或缺的部分[9]。人类的AKR1B10基因转化到293T细胞中后，可有效降低不饱和羰基对细胞的毒害作用[10]。老鼠的AKR7A1基因在中国仓鼠V79-4细胞中的表达也可提高细胞对丙烯醛和HNE的抵抗力[11]。这些试验结果表明，生理状态下的醛酮还原酶对细胞毒性羰基物质具有解毒功能。 　　尽管有关于高等脊椎动物、细菌和植物的醛酮还原酶分子的研究众多，但人们对于鱼类的醛酮还原酶基因及其功能却知之甚少。苯并芘（BaP）处理罗非鱼可显著提高其肝组织醛酮还原酶AKR1A1基因的大量表达，该研究结果提示罗非鱼的AKR1A1分子可能在BaP解毒过程中具有重要的作用[12]。在前期的研究中，笔者所在实验室克隆了黄鳝肝脏醛酮还原酶基因并构建了其原核表达载体。为进一步分析黄鳝醛酮还原酶在细胞抗羰基胁迫中的作用，笔者对比了含有重组黄鳝醛酮还原酶基因和不含该基因的大肠杆菌在受到丙酮醛和2，3-丁二酮等有毒羰基化合物胁迫后的存活率，分析了羰基化合物处理时间和浓度差异对细胞毒性的影响。这为深入了解鱼类的醛酮还原酶的羰基解毒作用和功能提供了重要参考资料。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验菌株和试剂 　　含pET-28a-EakR1重组质粒的BL21（DE3）菌株和含pET-28a空白质粒的BL21（DE3）菌株，由长江大学生物医药研究所保存；丙酮醛和2，3丁二酮，购买于Aladdin公司；其他试剂均为国产分析纯。 　　1.2 菌株活化及诱导表达检测 　　将重组阳性菌株和对照菌在含50 μg/mL Kan的LB平板上划线，在37 ℃过夜培养。挑取于单克隆LB液体培养基中，在37 ℃、250 r/min恒温摇床上培养4 h后，加入终浓度为 0.1 mmol/L 的IPTG，诱导培养3 h，取适量菌液用12%的 SDS电泳检测。 　　1.3 羰基化合物浓度大小对大肠杆菌存活率的影响 　　挑取阳性重组菌单克隆于6 mL含50 μg/mL Kan的LB液体培养基中，37 ℃、250 r/min培养3 h后，加入终浓度为 0.5 mmol/L 的IPTG，继续诱导表达1 h。将诱导培养液分装至6只EP管中，然后在EP管中加入丙酮醛（或2，3-丁二酮），使其终浓度为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L，进一步在37 ℃静置1 h。离心收集菌体，灭菌水洗涤3次后用1 mL新鲜液体LB重悬。取10 μL菌液进行101、102、103、104、105、106…倍梯度稀释。取稀释后的系列菌液50 μL涂布在含Kana的LB平板上后于37 ℃培养箱中恒温培养12 h。选择菌落数在100～500的平板，用Shineso公司的平板菌落计数仪进行菌落计数，根据相应稀释倍数推算稀释前的总菌落个数。计算出不同浓度丙酮醛（或2，3-丁二酮）处理后大肠杆菌的存活率（SC）。对照菌同样处理，重复3次。