二蛋白质研究方法课件.pptVIP

* 蛋白质研究方法 §3.蛋白质变性 protein denaturalization 蛋白质在某些理化因素的作用下，空间结构发生改变,导致生物学功能丧失,理化性质发生改变,称为蛋白质的变性。 仅空间结构发生变化，而一级结构不改变 1、鉴定 （1）测定蛋白质活性，如酶活 （2）测物理性质：O.D.，粘度，溶解度，圆二色性， 电泳迁移率等 （3）测化学性质：颜色反应（变性后加强） （4）免疫法测抗原性 2、变性因素 温度 热变性 pH ——破坏盐键 有机溶剂——削弱疏水作用 尿素，盐酸胍——氢键，疏水作用 表面活性剂 SDS与蛋白质结合后使其表面带有大量负电荷，非常稳定地溶解于水中 2、蛋白质的复性（renaturation） 蛋白质较轻程度的变性后，去除变性因素后，仍可恢复或部分恢复其原有的空间结构与功能（天然活性），称为复性。 第二章 蛋白质研究方法 蛋白质研究对象的选择和样品的获取 蛋白质检测和鉴定 蛋白质结构分析 蛋白质生物学功能分析 蛋白质研究的发展趋势 2、蛋白质的提取 破碎细胞：通过机械的方式，如研磨、超声、高压等 去垢剂处理溶解膜蛋白 许多蛋白质在体内与质膜结合，需要以去垢剂分离 包括：脱氧胆酸钠，SDS，Triton X-100, NP-40 稳定从细胞中释放的蛋白 加蛋白水解酶抑制剂：PMSF, Leupeptin, Aprotinin 低温操作 去除细胞碎片——离心 离心 悬浮在溶液中的各种粒子沉降速度是不一样的，质量越大、密度越高的粒子沉降速度越大。 相对离心力（×g)： RCF=F离心力/F重力=mω2x/mg=ω2x/g g=980 cm/s2 RCF = 1.119×10-5n2x n: 转数/分，x: 悬浮粒子离转轴的距离（厘米） 沉降速度 dx/dt = d2(ρp-ρm)ω2x/18η （eta） 沉降系数：单位离心力作用下粒子的沉降速度 （Svedberg单位，1S=10-13s） 3、蛋白质纯化 目的：把目标蛋白单独分离出来以供研究使用 方法：根据蛋白质自身性质，可以采用多种方法 分子大小：凝胶分子筛层析 溶解度：盐析 电荷：离子交换层析，等电点沉淀，电泳 特异亲和性：亲和层析 基因表达 （1）盐析 (salting out): 盐溶：溶液中离子强度较低时，蛋白质溶解度随着盐 浓度的增加而增加 盐析：当溶液离子强度较高时，蛋白质溶解度随盐浓度 的增加而降低 常用盐：Na2SO4, (NH4)2SO4; 透析或凝胶层析去除 （2）离子交换层析（ion-exchange chromatography） 利用表面带电荷的基团修饰过的树脂柱，在特定pH下和流过的蛋白溶液发生离子交换，并结合带相反电荷的蛋白质，从而分离纯化 阳离子交换树脂，CM-纤维素 CM52，CM32 阴离子交换树脂，DEAE-纤维素 DE52，DE23 Ion-exchanger chromatography （3）排阻层析： 根据蛋白质分子大小（球状蛋白）的差异来分离 葡聚糖凝胶(sephadex)，琼脂糖凝胶(sepharose) Sephadex G-10 ~ 200 Sephadex的型号以G值来表示，代表每克干胶吸水的量 G-200：20 ml/g G值越大，孔径越大，胶越软， 分子筛效应： 分子越大走的越快 Gel filtration chromatography （4）亲和层析（affinity chromatography） 根据要分离的目标蛋白能与某种被称为配基的其它分子特异性相互结合的特点而设计 配基可以是酶的底物，抗体/抗原，重组蛋白特异序列（GST-GSH；His6-Ni2+） （5）基因工程重组蛋白（Recombinant techniques） ?Clone the interested protein encoding gene in an expression vector with a purification tag added at the 5’- or 3’end of the gene ?Protein over-expression in a cell ?Protein puri