广东地区GNB3基因多态性和原发性高血压遗传易感性研究.docVIP

广东地区GNB3基因多态性和原发性高血压遗传易感性研究 　　【摘要】　目的　研究GNB3基因多态性与广东地区原发性高血压遗传易感性的关系。方法　收集广东地区有代表性的正常人和原发性高血压患者血液样本各50份，共100份。对GNB3（人类G蛋白β3亚单位）基因A（350）G位点PCR扩增，测序，后进行A（350）G位点基因分型，再利用统计学分析其与广东地区原发性高血压遗传易感性的关系。结果　高血压组和正常血压组的GNB3　A（350）G位点基因型分布分别为：GG：0.956、1.000；GA：0.044、0；AA：0、0.高血压组和正常血压组的GNB3　A（350）G位点等位基因分布分别为：G：0.978、1.000；A：0.022、0。结论　在广东人群中，尚未发现GNB3基因多态性与原发性高血压遗传易感性有关。 　　【关键词】　高血压；广东地区；GNB3　A（350）G位点 　　作者单位：作者单位：　510310　广东药学院赤岗校区（李海燕　黄旭琳　黄梓杨）；广东药学院附属第一医院（陈少莲）；广东药学院基础学院生物教研室（张咏莉） 近几年来对GNB3基因多态性与高胆固醇血症、冠心病、高血脂等关系的研究已成为国内外关注热点。研究GNB3　基因多态性与心血管疾病遗传易感性将有助于了解GNB3　基因在不同人群中分布情况，探索疾病的发病机制。有研究显示，GNB3　A（350）G多态性可影响到G2蛋白活性。近年报道GNB3　的基因A（350）G多态性与EH的关系，结果不一致。对德国［1］、澳大利亚人的一些研究报道A（350）G多态性与EH　有关联［2］，而来自日本［3］、法国、美国等的一些研究报道则无关联。到目前为止还未见到关于广东地区GNB3基因多态性与心血管疾病遗传易感性的研究报道，研究广东地区GNB3基因多态性与心血管疾病遗传易感性并与其他国家和地区人群对比，可以找到广东地区人群中与心血管疾病遗传易感性相关的GNB3基因型，对广东地区心血管疾病做出尽早的预防、诊断和治疗。 　　1　资料与方法 　　1.1　一般资料　2010年在广东药学院第一附属医院采集原发性高血压患者血样50份，均符合世界卫生组织高血压诊断标准，相互之间无血缘关系。 　　1.2　基因组DNA制备 　　1.2.1　采用传统的酚氯仿抽提法。 　　1.2.2　利用RNA/DNACalculator对所提DNA的质量和浓度进行测量。 　　1.3　GNB3　A（350）G位点PCR反应 　　1.3.1　引物序列 　　上游　5?AGA　GGA　TGG　TGG　GGT　TGG　GAG　G3? 　　下游5?GAG　GCT　GTG　AAA　GCA　GGG　GTC　AG3? 　　1.3.2　PCR反应体系 　　反应体系为　50　μl：　4　μL　DNA　溶液，2.5　U　Taq　酶，引物工作液浓度每条为0.4　μM，　dNTPs　每种终浓度0.2　μM，标准的PCR　buffer。 　　1.3.3　PCR　反应条件 　　预变性　95℃　5　min，后94℃　60　s，60℃　45　s，　72℃　60　s，共35个循环，72℃　7　min，4℃保存。 　　1.3.4　琼脂糖电泳： 　　PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳（离子强度0.5×TBE），100V恒压电泳30　min及凝胶自动成像分析系统检测结果。A（350）G扩增片段长度361bp，　约61bp处为本研究观察G→A突变点。 　　1.4　测序反应 　　1.4.1　PAG凝胶配制和灌胶　配制含7　mmol/l尿素的6%变性聚丙烯酰胺凝胶；将洗净晾干的凝胶板装上胶架，放置夹紧。量取50　mlPAG胶液，加入10%过硫酸胺260　μl，TEMED　25　μl，混匀后缓慢灌入胶板中，静止凝固大约3　h。 　　1.4.2　样品处理　取12　μl　去离子甲酰胺和0.5　μl　PE　GeneScan400　hD分子量内标，按上述比例混合成Loading　Buffer；取7　μl　Loading　Buffer　加入1　μl　PCR扩增产物（1/8稀释），混匀离心，然后于PCR仪上95℃变性4　min，后马上置于冰上，直至上样。 　　1.4.3　测序凝胶电泳　打开计算机和DNA自动测序仪主机，放置凝胶板。若玻板检测合格，倒入电泳液进行预电泳。停止后点样。用ABI　PrismTM　310　Collection　软件收集数据。电泳条件为1000V，30W，电泳2　h。 　　2　结果 　　2.1　人类基因组DNA提取　共提取正常人群和原发性高血压患群人类基因组样品100份。 　　2.2　GNB3　A（350）G位点的PCR反应　各样品PCR反应琼脂糖电泳图如下。 　　2.3　GNB3　A（350）G位点