断肠草和金银花类药材水提液特异性PCR鉴定方法研究.docVIP

断肠草和金银花类药材水提液特异性PCR鉴定方法研究 　　[摘要] 目的： 研究断肠草与金银花类药材水提液的DNA分子鉴别方法。方法： 采集不同产地的断肠草药材13份、金银花32份、山银花21份和水银花5份，所有样品提取总DNA，并对断肠草、金银花、山银花的水提液进行DNA提取。通过对断肠草 psbA-trnH 片段进行扩增、测序，并搜索GenBank数据库中收录的中金银花类药材基原植物 psbA-trnH 序列，进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物。结果： 通过使用特异性引物对所有样品进行PCR扩增，发现断肠草可扩增出97 bp片段，而金银花类药材则不能扩增出条带。结论：通过特异性PCR的方法实现了断肠草与金银花类药材水提液的快速、准确鉴别。 　　[关键词] 断肠草；水提液；特异性PCR；分子鉴定 　　[收稿日期] 2013-01-16 　　[基金项目] 北京市科技专项“道地中药功能基因组北京市重点实验室2012年阶梯计划项目”；贵州省中药现代化科技产业研究开发专项（黔科合ZY字[2013]3001号）；公安部重点研究计划项目（2013012DYJD07） 　　[通信作者] *袁媛，E-mail：yuanyuan@icmm.ac.cn 断肠草为马钱科植物钩吻 Gelsemium elegans （Gardn.el Champ） Benth. 的茎藤。又名胡蔓藤、野葛、水莽草、大茶叶、烂肠草，是一种剧毒草药[1]。有祛风攻毒、消肿、止痛之功效。可治湿疹、痈肿、风湿痹痛等[2-3]。由于断肠草常常缠绕和混杂在其他植物中，且其花蕾形状与具有清热解毒功能的金银花 Lonicera japonica Thunb.极为相似。由于二者较难辨认、容易混淆，近年来调查发现误将断肠草为金银花煮水当凉茶喝而中毒的事件时有发生，在断肠草中毒的78例临床事件中，发现43例为因误将断肠草为金银花煮水当凉茶喝而中毒[4]。因此，建立一种用于快速鉴别断肠草和金银花水提液的方法对保障人民群众生命安全是十分重要的。 　　目前，国内外一般采用高效液相色谱法、气相色谱—质谱联用法等通过分析断肠草中的生物碱的含量对断肠草进行鉴定[5-8]；但这些方法比较繁琐，不利于推广。近年来，药材分子鉴别技术如DNA条形码、位点特异性PCR等方法迅速发展，其克服了药材传统鉴别方法中样品需求量大、主观性大等问题。其中位点特异性PCR方法已成功用于人参、陈皮、藁本、金银花等中药材的真伪鉴别[9-12]，但对断肠草与金银花等易混品之间的分子鉴别还尚未见报道，而且通过分子手段鉴别药材水提液的报道也相对较少。本研究建立了水提山银花药材的DNA提取方法，同时通过特异性PCR的方法实现了断肠草与金银花类药材水提液的快速、准确鉴别，为今后中毒诊断提供参考依据。 　　1 材料 　　2×CTAB提取液，1×TAE缓冲液，琼脂糖（Promega公司），溴化乙锭（Fluka公司），DNA Taq 聚合酶（Takara公司），2 000 bp DNA Markar（Takara公司），三氯甲烷﹑无水乙醇﹑异丙醇均为国产分析纯。 　　PCR仪（德国Eppendorf， 型号5332），电泳系统（北京市六一仪器厂，型号DYY-12），低温冷冻离心机（德国Eppendorf， 型号5810R），紫外凝胶成像分析仪（英国Syngene， 型号GBOXHR），混合型球磨仪（德国Retsch，型号MM400），数控超声波清洗器（型号KQ-500DE），微量移液器（德国Eppendorf）。 　　本实验选取71份材料：包括采自广西的断肠草7份；采自贵州的断肠草3份，采自安徽的断肠草3份，金银花25份，分别采自山东、河南、广西、江苏和北京；山银花20份，分别采自广西、云南、贵州和山东；水银花5份，采自广西；以及7批购自市场上经过炮制处理的金银花药材和1批山银花样品。凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心和广西药用植物园，见表1。 　　表1 实验材料 　　Table 1 Plant samples 　　2 方法 　　2.1 鉴别引物的设计 选择通用引物 psbA-trnH （上游引物 psbA：5′-GTT ATGCATGAACGTAATGCTC-3′；下游引物 trnH：5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC -3′）对断肠草样品进行扩增，经过PCR扩增后，PCR产物由北京六合华大基因科技股份有限公司测序部测序。搜索Genbank中金银花的 psbA-trnH 序列（Genbank登录号GU1353313.1；JN045253.1），然后进行同源比对，根据其变异区使用primer premier 5.0软件设计一对特异引物GEF1/GER1，设计的特异引物扩增片段大小