铜绿假单胞菌整合子和多重耐药性研究.docVIP

铜绿假单胞菌整合子和多重耐药性研究 　　【摘要】 目的 在铜绿假单胞菌中检测1类整合子并分析整合子对细菌耐药性的影响。方法 用VITEK-AMS微生物自动分析仪鉴定细菌和药敏试验，用PCR方法扩增I类整合酶基因，经电泳后检测扩增产物。结果 158株铜绿假单胞菌中检测出1类整合子42株，检出率为26.6%。1类整合子阳性菌对氨基糖苷类、喹诺酮类及头孢菌素类药物表现出较高的耐药率。携带1类整合子菌株易表现出对至少4种抗菌素的多重耐药性，其多重耐药率为68.6%（33/48），明显高于1类整合子阴性菌株（28.6%），P0.05。结论 1类整合子广泛存在铜绿假单胞菌中，1类整合子对细菌多重耐药性的产生和传播起着重要作用，应加强临床细菌基因水平的耐药监测，采取有效措施防止耐药性的传播。 　　【关键词】 铜绿假单胞菌；整合子；多重耐药 　　随着抗生素的广泛使用和不合理使用，细菌的耐药性问题日益严重。铜绿假单胞菌是引起医院感染重要的条件致病菌，对严重基础性疾病和免疫缺陷的住院患者常导致侵袭性感染，会对患者的生命产生严重威胁。铜绿假单胞菌耐药机制比较复杂，面对不同的抗生素耐药，会使得感染源频繁发生，更有可能会引起部分铜绿假单胞菌的流行，变成难以解决的医学难题，分析细菌整合子的耐药基因的类别和表达，能够帮助对铜绿假单胞菌多重耐药性的发生和转移机制的了解，给临床治疗提供有效的参考。本文对158株铜绿假单胞菌进行分析，以探讨铜绿假单胞菌整合子与其多重耐药性之间的关系。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 菌株来源 2012年3月――2012年10月从我院临床标本中分离的铜绿假单胞菌158株。标本分别来自ICU病房（53株）、呼吸科病房（49株）、普外科病房（28株）、泌尿科病房（16株）和内分泌病房（12株）。菌株分别分离自痰标本（68株）、脓汁（42株）、咽拭子（18株）、尿标本（12株）、伤口分泌物（10株）和血液（8株）。标准质控菌株为铜绿假单胞菌（ATCC27853）。携带1型整合子铜绿假单胞菌为本实验室分离株经测序证实，作为PCR实验阳性对照。 　　1.1.2 鉴定卡片 全自动微生物分析仪（VITEK-AMS）采用的GNI鉴定卡、GNS药敏卡均购自法国Biomerievx公司，GNS药敏卡包括氨苄青霉素、庆大霉素、环丙沙星、阿莫西林/克拉维酸、头孢他啶、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、丁胺卡那、复方新诺明、头孢噻肟、亚胺培南11种抗菌药物。 　　1.1.3 PCR试剂 TaqDNA聚合酶，4种dNTP混合液，DNA分子标准参照物购自Takara公司；琼脂糖，溴化乙啶等常用分子生物学试剂购自上海生工公司。 　　1.1.4 主要仪器 VITEK-AMS自动鉴定系统购自法国Biomerievx公司；PCR扩增仪、DNA/RNA/protein analyzer分析仪和高速低温离心机购自德国eppendorf公司；PCR电泳仪为北京崇文东方仪器厂产品；DGW-99型台式高速微型离心机为宁波新芝科器研究所产品。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 菌株鉴定 所有菌株都用VITEK AMS 分析仪GNI细菌鉴定卡进行菌种鉴定。体外药物敏感试验：采用GNS检测卡测定13种抗菌药物对158株铜绿假单胞菌的MIC值，操作方法按照VITEK AMS规定的方法进行。 　　1.2.2 加热裂解法制备DNA模板 用Luria-Bertani液体培养基200r/min振荡培养8h获得对数生长期菌株。携带1型整合子铜绿假单胞菌为本实验室分离株经测序证实，作为PCR实验阳性对照。 　　1.2.3 筛选1型整合子阳性菌株 用PCR方法扩增整合子可变区，以整合子上游引物ggcatccaagcagcaagc和整合子可变区下游引物aagcagacttgacctgat，进行PCR扩增。50ulPCR反应体系为：DNA100ng、25mmol/LMgCl2、0.4mmol/LdNTP、0.4pmol/L引物和2.5UTaq酶。PCR反应循环参数设置如下94℃预变性4分钟；94℃45秒，55℃，45秒，72℃3分钟，循环35次；最后72℃延伸10分钟。 　　1.2.4 PCR反应结束后取产物琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下拍照记录结果 　　1.2.5 统计学处理 采用χ2检验，P0.05有显著差异。统计软件为SPSS10.0。 　　2 结 果 　　2.1 1类整合子基因检测结果 全部158株铜绿假单胞菌的DNA上有42株检测到I类整合子，占细菌总数的26.6%。1类整合子的大小分别为600bp、1000bp、1600bp、1900bp和2100bp。根据各株细菌质粒DNA上检测到1类整合子的大小和数目，细菌质粒NDA上的整合子可分