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十一株棕色蘑菇栽培性状及亲缘的关系分析 　　棕色蘑菇（??Agaricus bisporus??），在市场上又被称为褐色双孢菇，国外习惯称之为褐菇（Portabella，Portabello），菌盖为自然棕褐色，货架寿命长，其营养、口感和香味更接近于野生口蘑，市场价格比白色双孢蘑菇高出20%左右[1]，是一个极具开发前景的商业品种。我国棕色蘑菇栽培发展较晚，品种也比较少。笔者收集了11株目前国内棕色蘑菇的主栽品种，分别采用酯酶同工酶及rDNA ITS序列对这些菌株的亲缘关系和遗传多样性进行了初步分析，以期为棕色蘑菇的遗传育种和栽培生产提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1??供试菌株 　　供试的11株棕色蘑菇菌株均为目前国内主栽品种。菌株001、003、004和010由山东省农业科学研究院选育保藏，菌株005由湖北环宇食用菌研究所提供，006由河南农业大学提供，007由云南省农业科学院提供，008由辽宁田园食用菌有限公司提供，009由福建九湖食用菌研究所提供，SB65和SB295由美国Sylvan公司提供。 　　1.2?ε嘌?基 　　母种培养基（复合PDA培养基）（g/L）：土豆 200，葡萄糖 20，KH????2PO????4 3，MgSO????4?7H????2O 1.5，VB????1 0.01，琼脂 15，pH自然。?? 　　原种和栽培种培养基[2]：麦粒85%，牛粪15%，含水量65%。?? 　　栽培料：麦秸60%，牛粪30%，磷肥2.5%，复合肥1%（碳、氮含量分别为15%），尿素1%，石灰4%，石膏2%，含水量65％。 　　1.3?υ耘嗍匝? 　　按参考文献[2]的方法制作母种、原种、栽培种。培养料堆制发酵20 d，期间3次翻堆，然后上菇床经二次发酵制备发酵料，再将发酵好的培养料均匀地铺在床架上，每平方米铺发酵料??40 kg。按参考文献[2]进行床式栽培和出菇管理。采用随机区组试验设计，每个品种分3个区组并随机分布，每个小区试验面积为15 m2（长??7.5 m，宽2 m），标记不同品种栽培小区，待料温降到28 ℃以下开始播种，播种量为10瓶/小区（500 g/瓶），采用撒播法播种。发菌期保持菇棚内温度20～25 ℃、湿度80%，晚间适当通风，菌丝经20 d发满床面后进行覆土出菇，待菇体6~7成熟，菌膜未破时开始采收，共收3潮菇。每个菌株随机选取100个正常子实体，记录菌盖直径、厚度，菌柄长度、直径，单菇重量，并计算鲜菇产量和生物学效率。 　　1.4??酯酶同工酶分析 　　各供试菌株经PDA斜面活化（25 ℃培养??7 d）后，接种到复合PDA平板上，待菌丝长满平板后，刮取菌体用于同工酶分析和DNA提取。样品制备及聚丙烯酰胺凝胶电泳参照文献[4]的方法进行。根据同工酶电泳图谱构建酯酶同工酶模式图。 　　1.5??ITS序列分析 　　DNA提取参照文献[5]的方法进行。PCR扩增采用真菌核糖体间隔区通用引物ITS1和ITS4（ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC）进行[6]，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。扩增反应体系为：2×PCR ??Taq??mix（天根生物科技有限公司）25 μL，DNA模板1 μL，ddH????2O 22 μL，引物（10 μmol/L）1 μL×2，总体积50 μL。扩增反应在伯乐MyCycler PCR扩增仪上进行。反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，??60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，??72 ℃延伸10 min。实验重复3次。?? 　　扩增产物经凝胶回收试剂盒（SK1131，上海生工）纯化后，克隆到T载体上（pUCM??T，上海生工），参照试剂盒说明书方法鉴定假阳性，每个菌株选3个阳性克隆交付上海生工生物工程技术服务有限公司测序，将最终获得的ITS序列用Clustal W进行多序列联配后用MEGA4建系统进化树，经bootstrap法1 000次循环检验系统树的可靠性。 　　2 结果与分析 　　2.1?Ω髯厣?蘑菇菌株形态特征及栽培性状 　　各菌株生长发育时间、子实体性状及产量见表1，各菌株子实体菌盖幼时为半球形，后平展，菌盖浅褐色至棕褐色，表面光滑；菌盖直径5.27~8.32 cm。菌柄柱状，中部松软，柄长5.83～??7.43 cm；菌褶幼时粉红色，成熟后呈咖啡色，宽0.39~0.69 cm。担子上着生4个孢子，罕为2个；孢子椭圆形、光滑、褐色。从形态特征来看，各菌株均为棕色蘑菇，但在子实体大小及形态上具有一定的差异。不同菌株从接种到现蕾时间为29~45 d，采收时间为37~55 d，这些性状反映了各菌株生