超临界流体技术构建共载siRNA和紫杉醇复合微粒的分析-生物化工专业论文.docxVIP

摘要 摘要 华侨大学硕士学位论文 华侨大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 万方数据 万方数据 摘 要 在癌症治疗方面，共载基因和抗癌药物进行联合治疗，能够取得良好的抗 癌效果，因此共载载体的选择和构建具有重要意义。本文采用离子凝胶法和超 临界强制分散悬浮液法（SpEDS）制备了壳聚糖纳米粒和壳聚糖纳米粒/聚乳酸- 聚乙二醇-聚乳酸三嵌段共聚物复合微粒，对壳聚糖纳米粒和复合微粒的粒度和 形貌进行了优化，同时进行了一系列理化性能的表征，并从细胞水平上对载体 细胞毒性和共载 siRNA 和紫杉醇（PTX）复合微粒的抗癌活性进行了初步评价。 论文主要研究工作概括如下： 壳聚糖纳米粒的制备：分别对壳聚糖纳米粒进行 DLS、SEM、TEM、FTIR、 DSC 和 TGA 以及凝胶电泳实验的表征。单因素考察实验的结果表明，壳聚糖纳 米粒的粒径随壳聚糖（CS）浓度增大而增大；三聚磷酸钠（TPP）浓度对粒径的 影响不明显，当 TPP 为 1 mg/mL 时，粒径最小；壳聚糖纳米粒粒径随着 pH 的 增大先减小后增大，pH 在 5.0 时，所制得的纳米粒粒径最小；当 CS/TPP 质量比 恒定时，粒径随 CS/TPP 体系浓度的增大而增大。根据实验结果得到优化条件为： 壳聚糖浓度为 2 mg/mL，TPP 浓度为 1 mg/mL，壳聚糖溶液 pH 为 5.0。此条件 制得的壳聚糖纳米粒粒径在 50 ~ 100 nm 之间，粒径分布窄；FTIR 表征表明了 TPP 的磷酸根与 CS 氨基位点作用，TPP 连接到了 CS 的氨基上。凝胶电泳实验 显示，CS 能够实现对 siRNA 的有效包封，且 TPP 的加入使得包封效果得到提高， 包封率为 96.97%。 复合微粒方面：对复合微粒的制备工艺参数进行优化，并对复合微粒进行 DLS、SEM、TEM、FTIR、DSC 和 TGA 表征。Minitab 全因子设计实验结果显 示溶剂/非溶剂比为影响复合微粒粒径最为显著的影响因素。当油相浓度为 5 mg/mL、水油比为 0.75:10.00、溶液流速为 2 mL/min、溶剂/非溶剂比为 0.5:1.0 时制得的复合微粒球形度较好，粒径和 Zeta 电位符合等值图所预测的结果：200 ~ 500 nm，-30 ~ -50 mV；优化组复合微粒的透射电镜图显示，复合微粒具有一 定的核壳型结构；FTIR 和 DSC 表征结果表明，超临界过程前后各物质的官能团 未发生明显变化，但其物理状态发生了一定的变化，材料的高温结晶区消失或 向低温结晶区转变，晶型更加均匀；HPLC 结果显示，随着 PTX 投药量的增加， I PTX 的载药量和包封率也逐渐增大，但其平均粒径和表面形貌变化不大。 细胞水平毒性评价和抗癌活性方面：壳聚糖纳米粒和复合微粒在体外对细 胞生长无明显抑制作用，具有良好的生物相容性。细胞毒性、溶血率和急性全 身毒性结果显示，经 SpEDS 过程制得的复合微粒具有良好的生物相容性；在抗 癌活性方面，细胞摄取、细胞凋亡观察（AO/EB）和抗癌活性（Alamar Blue） 检测结果表明，复合微粒能够在人乳腺癌细胞 Bcap-37 细胞核附近聚集，且共载 siRNA 和 PTX 的复合微粒取得了显著的联合治疗效果。 综上所述，经优化后的复合微粒球形度较好，粒径在 300 nm 左右，具有一 定的核壳结构和较好的生物相容性。复合微粒能够在细胞核附近聚集，共载 siRNA 和 PTX 的复合微粒对 Bcap-37 细胞具有良好的抗癌活性，有望进一步应 用于共载基因和抗癌药物进行多药耐药肿瘤的联合治疗。 关键词：超临界流体 聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸三嵌段共聚物 siRNA 紫杉醇 联合治疗 II Abstract Abstract 华侨大学硕士学位论文 华侨大学硕士学位论文 Abstract In the field of cancer therapy, co-delivery of gene and antitumor drug can achieve a better antitumor effect than single drug, and the development of the co-delivery carrier is very important. In this study, the method of ionic gelation and process of suspension-enhanced dispersion by supercritical fluids (SpEDS) were used to prepare chitosan nanoparticles (CS NPs) and CS NPs/poly(L-lactid