草酸钙尿石症患者肾脏组织中维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1的初步研究-外科学(泌尿外科)专业论文.docx

华中科技大学博士学位论文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 PAGE 10 PAGE 10 草酸钙尿石症患者肾脏组织中维生素 K 环氧化物还原酶复合物 亚单位 1 的初步研究 博士研究生： 胡波 导 师： 刘继红 教授 中文摘要 第一部分 草酸钙尿石症患者肾脏组织中维生素 K 环氧化物还原酶 复合物亚单位 1（VKORC1)基因的表达研究 目的 对维生素 K 环氧化物还原酶复合物亚单位 1 在草酸钙尿石症患者肾脏组织 中的表达进行检测，探讨维生素 K 环氧化物还原酶复合物亚单位 1（VKORC1) 与草 酸钙尿石形成之间的关联性。 方法 收集 2004 年 11 月至 2010 年 4 月武汉同济医院肾脏组织标本 155 例，分成 3 组：结石组、对照组 A (非结石性肾积水组)和对照组 B（正常对照组），应用免疫组 织化学分析法、免疫荧光显微镜检查法、蛋白质印迹法 (western blot) 和 SYBR Green I 荧光实时逆转录聚合酶链反应 (realtime RT-PCR) 技术对肾脏组织中 VKORC1 蛋白 进行定位和表达差异的研究。 结果 免疫组织化学分析法和免疫荧光显微镜检查发现在结石组和对照组肾脏组 织中都有 VKORC1 表达，主要存在于肾小管上皮细胞的细胞质内；蛋白质印迹法提 示在结石组患者肾脏组织中 VKORC1 蛋白的表达（0.327± 0.055）明显低于其他 2 个 对照组（0.913± 0.090、0.983± 0.117），差异具有统计学意义（P 0.05），对照组间的 差异无统计学意义（P 0.05）；SYBR Green I 荧光实时逆转录聚合酶链反应提示结石 组患者肾脏组织中的 VKORC1 mRNA（倍数：6.063± 5.275）表达明显低于 2 个对照 组 (倍数：26.324± 10.632、27.167± 14.248) ，差异具有统计学意义（P0.05），对照组 间的差异无统计学意义（P 0.05）。 结论 VKORC1 主要在肾小管上皮细胞胞质内表达，草酸钙尿石症患者肾脏组织 中 VKORC1 的表达降低，可能与草酸钙尿石的形成有关。 关键词 维生素 K 环氧化物还原酶复合物亚单位 1;草酸钙尿石;免疫组织化学法 蛋白质印迹法;荧光实时逆转录聚合酶链反应 第二部分 维生素 K 环氧化物还原酶复合物亚单位 1（VKORC1) 基 因剪接异构体在草酸钙尿石症患者肾脏组织中的表达和鉴定 目的 对维生素 K 环氧化物还原酶复合物亚单位 1（VKORC1）基因剪接异构体 在草酸钙尿石症患者肾脏组织中的表达和鉴定进行分析研究。 方法 收集 2004 年 11 月至 2010 年 4 月武汉同济医院草酸钙尿石症患者肾脏组织 标本 65 例，应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法对肾脏组织中的 VKORC1 基因进行扩增，将 PCR 产物进行纯化回收后，通过直接测序和克隆测序的方法对得 到的肾脏组织中 VKORC1 基因剪接异构体进行分析。 结果 应用逆转录聚合酶链式反应的方法成功在草酸钙尿石症患者肾脏组织中扩 增出 VKORC1 基因，并且得到 2 个剪接异构体，经过 3% 琼脂糖凝胶电泳显示一条 约 500bp 的电泳条带（V1）和另一条约 400bp 的电泳条带（V2），经过测序鉴定后发 现二者碱基序列相差 110bp，二者其余序列完全一致。 结论 草酸钙尿石症患者肾脏组织中存在 VKORC1 基因的剪接异构体。 关键词 肾脏;草酸钙尿石症;维生素 K 环氧化物还原酶复合物亚单位 1;逆转录聚 合酶链式反应 第三部分 草酸钙尿石症患者肾脏组织中维生素 K 环氧化物还原酶 复合物亚单位 1（VKORC1) 基因 3’-非翻译区（3’-UTR）和 5’-非 翻译区（5’-UTR）的扩增和鉴定 目的 对草酸钙尿石症患者肾脏组织中维生素 K 环氧化物还原酶复合物亚单位 1 （VKORC1) 基因的 3’-非翻译区（3’-UTR）和 5’-非翻译区（5’-UTR）进行扩增和鉴 定，探讨维生素 K 环氧化物还原酶复合物亚单位 1 基因 3’-非翻译区和 5’-非翻译区的 分子变异与草酸钙尿石形成之间的关系。 方法 收集 2004 年 11 月至 2010 年 4 月武汉同济医院草酸钙尿石症患者肾脏组织 标本 65 例，提取肾脏组织中的总 RNA 进行逆转录生成 cDNA 后，应用 cDNA 末端快 速扩增（RACE）方法扩增维生素 K 环氧化物还原酶复合物亚单位 1（VKORC1) 基 因 3’-非翻译区和 5’-非翻译区，将扩增得到的产物进行纯化后测序。测序结果与 NCBI 核酸数据库进行在线比较，应用生物信息学分析得到的 VKORC1 基因碱基序列，核 苷酸序列