草酸青霉产β-葡萄糖苷酶发酵条件优化及其基因克隆的初步研究-微生物学专业论文.docx

版权声明 版权声明 本论文及相关图表、数据、结果等内容，未经论文作者 和老师允许，不得公开或转载。 特此申明。 61 前言 前言 草酸青霉产β- 草酸青霉产β- 葡萄糖苷酶发酵条件优化及其基因克隆的初步研究 PAGE PAGE 13 PAGE PAGE 10 1 前言 β-葡萄糖苷酶(betaglucosidase, EC 3.2.1.21)，又称 β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它可 水解结合于末端非还原性的 β-D-糖苷键，同时释放 β-D-葡萄糖和相应的配基[1]，此外还 能微弱地水解对硝基苯-β-D-半乳糖和 β-D-木糖苷[2]。β-葡萄糖苷酶在食品、造酒、医药、 化学工业以及粮食加工等许多方面具有广阔的应用前景，近几年已成为人们研究的热 点。 1. 1 β- 葡萄糖苷酶的来源 β-葡萄糖苷酶广泛存在于植物、动物及微生物中（Woodward and Wiseman,1982）， 特别是植物的种子和微生物中尤为普遍。1837 年 Liebig 和 Wohler 首次在苦杏仁中发现 该酶，从而使杏仁成为 β-葡萄糖苷酶的经典来源[3]。 该酶在植物不同的组织器官中均有分布，其中表达最多的区域是种子[4]，在叶、茎 干、根表皮、果实、种皮中的分布则随着植物种类不同而变化[5,6]；在细胞水平上，β- 葡萄糖苷酶在细胞质、细胞壁、叶绿体、胞质丝、液泡中均有存在[7]。目前已有科学家 从苹果籽[8]、李[9]、番木瓜[10]、杏仁[11]、黑樱桃[12]、水稻[13]、大豆[14],木薯[15]中分离出 β- 葡萄糖苷酶。 对于动物中所含 β-葡萄糖苷酶，目前主要报道的为福寿螺和嵘螺，其内脏中富含高 活力的纤维素酶系[16,17]。 在微生物来源方面，细菌中研究得较多的是芽抱杆菌属[18]，真菌主要为曲霉类及木 霉类。其中细菌多产胞内 β-葡萄糖苷酶，且产量不高，因此对 β-葡萄糖苷酶的研究主要 集中在真菌中。Iwashita K 等人[19]从 Aspergillus kawachii IFO4308 中分离出了两个胞外 β- 葡萄糖苷酶和 1 个细胞壁束缚的 β-葡萄糖苷酶。Riou C 等人[20]利用 Aspergillus oryzae 发酵得到两种截然不同的 β- 葡萄糖苷酶， Shyh Liang Sim[21] 研究了假丝酵母 C.wickerhamii 以泡菜盐水作为培养基生产胞外 β-葡萄糖苷酶。1980 年，Jones 和 Kosman[22] 从黑曲霉中分离出了一种 β-葡萄糖苷酶，随后 Adikane 等于 1985 年，Yin 等[23]于 1992 年，Khawar 等[24]于 1994 年，Busto 等[25]. Kim 等[26], Terutaka 等[27]于 1997 年，Johansson 等[28]于 1998 年，Abdel-Naby 等[29]于 1999 年，Bravo 等[30]和 Siegel Dan 等[31]于 2000 年 分别从黑曲霉中纯化得到不同的 β-葡萄糖苷酶组分。国内的宛晓春[6]、张哲[17]、孙迎庆 [32]、汪大受[33]、陈向东[34]、王沁[35,36]、姚卫蓉[37]、艾云灿[38]、李平[39]、张曙光[40]、陈 清西[41]、曾宇成[42] 、孙力军[43]等学者先后采用硫酸铵沉淀和柱层析等方法从微生物中 分离纯化出 β-葡萄糖苷酶，并对其性质和应用作了研究。 动植物中存在的 β-葡萄糖苷酶培养周期较长，提取工艺较为复杂，成本高，可操作 性较差，而且酶活性也不高；微生物具有繁殖迅速，生产周期短，易于工业化等特点， 但发酵产酶菌株及培养条件的研究均不成熟。目前该酶仍然从苦杏仁中提取生产，国内 尚未实现工业化生产。因此寻找或构建理想的 β-葡萄糖苷酶菌株，探索更完善的发酵产 酶工艺成为 β-葡萄糖苷酶研究的当务之急。 1. 2 β- 葡萄糖苷酶的分类和结构 根据氨基酸序列分类，人们将 β-葡萄糖苷酶划分在糖苷水解酶家族 1 和 3 中。家族 1 中的 β-葡萄糖苷酶来自于细菌、植物和哺乳动物；家族 3 中的酶来自于真菌、细菌和 植物中。家族 1 中的酶除有葡萄糖苷酶活性外，还有很强的半乳糖苷酶活性(Henrissat B.1991)[44]。根据高级结构的相似性，糖苷酶家族可以被分成若干部族(Clan)，糖苷水解 酶家族 1 属于‘clan GH-A’(superfamily4/7)。其特点是催化结构域具有 8 个(β/a)桶状结构， 两个羧基氨基酸参与催化反应，作为质子供体和亲核基团，分别位于第 4 位和第 7 位的 β 折叠上(Jenkins J,1995)。Moracci 等用定点突变的方法证明保守序列中的两个 Glu