草酸青霉纤维二糖水解酶基因cbhⅠ克隆及表达-微生物学专业论文.docxVIP

河北大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所楚交的学位论文，是本人在导赔指导下进号子的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除了文中特黠加以样注和致谢的地方外，论文中不 包含其他人己经发表成撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教畜扭 构的学位或ìiE书所使用过的材抖。与我一间工作的问志对本研究所做的任何贯献 均己在论文中作了确确的说明并表示了致谢。 作者签名: 令斗 日期:卫lL年 6 0 EI 学位论文使用授权声萌 本人完全了解闷北大学有关保留、使用学位论文的规定，部:学校有权保雷 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以来 ffl 影印、缩印或其他复制手段保存 论文。 本学位论文属于 1、保密口，在 年一一一月……_B解密后适期本授权声费。 2、不保密-do 〈靖在斟上相店方格内 1T，， ) 作者签名: 名字 11+ 导师签名: 注τYU斗r  5期:…卫!主年… 月 [0 臼 日期:且让三年j一月 (0 EI 保护知识产权声明 争飞政备毒勤地 L 糕点解幽 本人为申请河北大学学位所提交的题目为(基 lclJhl甜;在蹬扎在总〉 的学位论文，是我个人在导师 44给指导并与导师合作下取得的研究成果，研 究工作及取得的研究成果是在问北大学所提供的研究经费及导婷的研究提费资 助下完成的。本人完全了解并严格遵守中华人民共和霞为保护知识产权所制定的 各项法律、行政法规以及到花大学的相关规定。 本人声明如下:本法文的成果归河北大学所有，未经征得指与李教师和河北大 学的书亩胃意和授枝，本人保证不以任向形式公开和传播科研成果和科研工作内 容。如果违反本声明，本人愿意承担相服法律责任。 明人: 在才 日期:…挂15 1f._6_丹 o 日 作者签名:堂堂 导师签名:飞乌兰、生 \  日期:旦!主一年i-RJLB 期z 翌土年. {， jJ (4 B 摘 摘 要 摘 要 纤维素是自然界中含量十分丰富的有机物，其完全降解过程需要几种酶的共同参 与、协调配合。纤维素酶具有催化效率高、安全性好等优点，在纺织、洗涤、动物饲料 添加剂等方面应用广泛。 本实验室选育的纤维素酶产生菌草酸青霉（Penicillium oxalicum）X10-279，遗传性 状稳定，滤纸酶活为 16.70 IU/mL。在纤维素酶的共同参与下，纤维素降解生成葡萄糖， 纤维二糖水解酶(CBH ?)是纤维素酶系中唯一可以作用于结晶纤维素的组分，在纤维素 降解过程中起重要作用。本研究克隆并在大肠杆菌中表达草酸青霉 X10-279 纤维二糖水 解酶基因 cbh?，希望能够获得高纤维素活性的重组菌，从而提高纤维素的降解效率。 根据 GenBank 中已发表的青霉属来源的纤维二糖水解酶基因 cbh?，分别设计含有 EcoR? 和 Not? 限制性酶切位点的正向引物和反向引物。以草酸青霉 X10-279 基因组 DNA 为模板，进行 PCR，将回收得到的 PCR 产物与克隆载体 pMD18-T 连接，转化至大肠杆 菌（Escherichia coli）Top 10 感受态细胞中，将重组菌进行测序，重组质粒命名为 pMD18-T-cbh?。生物信息学分析表明：克隆得到的 X10-279 纤维二糖水解酶基因 cbh? (GenBank，获得基因登录号 KR269867，蛋白登录号 AKI32221) 全长 1632 bp，无内含 子，编码 543 个氨基酸和一个终止密码子。与斜卧青霉（Penicillium decumbens）CBH ? （GenBank 登陆号 ACV95805）的同源性最高，氨基酸序列同源性达 98.70%。蛋白理论 分子量为 56.66 kD，理论等电点为 4.79，属于糖基化水解酶第 7 家族。 重组质粒 pMD 18-T-cbh? 双酶切获得的 cbh? 与表达载体 pET-28a(+)连接，转化至大 肠杆菌 BL21(DE3)中，成功构建了重组菌 pET-28a(+)-cbh?/BL21。目的蛋白在宿主中实 现了大量表达，但主要以包涵体的形式存在。对诱导条件进行优化，确定最佳诱导条件 为：当 OD600 达到 0.3~0.4 时，加入 IPTG 至终浓度为 0.8 mmol/L，在 37℃诱导 5 h，目 的蛋白的表达量达到 15.14 mg/L，比优化前提高了 50.49%。 利用 Ni 柱对包涵体进行纯化，纯化后蛋白的表达量为 3.29 μg/mL，收率为 21.35%。 对目的蛋白进行复性，复性后蛋白的 pNPC 酶活为 10.3 U/L，比活力为 94.3 U/mg，最 适 pH 为 5.0，最适温度为 55℃，且具有较好的温度适应性。 关键词 草