比色法测定大血藤中总黄酮含量ぜ捌淝宄DPPH自由基的研究.docVIP

比色法测定大血藤中总黄酮含量ぜ捌淝宄DPPH自由基的研究 　　摘要：以中药材大血藤[Sargentodoxacuneata（Oliv.）Rehd.etWils]的乙醇提取物为对象，提出1种基于比色法的大血藤总黄酮测定方法，同时考察了提取物对DPPH自由基的清除能力。结果表明，以芸香苷为标准品的亚硝酸钠-硝酸铝显色法更适合大血藤提取物中总黄酮含量的测定，测定波长为510nm，芸香苷在0～0.5mg/mL范围内，质量浓度与吸光度呈良好的线性关系，平均加样回收率为99.3%，精密度、稳定性、重现性均理想；抗氧化活性试验结果表明大血藤提取物具有很强的清除DPPH自由基能力。 　　关键词：大血藤；总黄酮；紫外-可见分光光度法；抗氧化性；自由基 　　中图分类号：R284.2文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0356-03 　　中药大血藤是木通科植物大血藤[Sargentodoxacuneata（Oliv.）Rehd.etWils.]的干燥藤茎，具有清热解毒、活血、祛风止痛等功效，主治肠痈腹痛、热毒疮疡、经闭、跌扑肿痛、风湿痹病等症，主要产自湖北省、四川省、江西省、浙江省、江苏省、福建省等地。大血藤在不同地区名称不一，《中药大辞典》记录的别名有：血藤、过山龙、红藤、千年健、血竭、血通、大活血、活血藤等10多种[1]。研究表明，大血藤含有多种化学成分，包括黄酮类、酚类、有机酸、木脂素、三萜皂苷、蒽醌类、糖苷类等物质，具有抑菌、抗炎、抗病毒、抑制血小板聚集、增加冠脉血流量、抗心肌等功效[2-6]。黄酮类化合物具有较强的抗氧化、抗肿瘤、抗炎镇痛、抗病毒、保肝护肝、保护心血管系统、抑菌、抗衰老、提高免疫力等功效。大血藤中黄酮类化合物受到很多研究者的关注[7-13]。本研究以中药材大血藤的乙醇提取物为对象，提出一种基于比色法的大血藤总黄酮测定方法，同时考察了提取物对DPPH自由基的清除能力，旨在为开发利用大血藤资源提供依据。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　大血藤药材购于福建省漳州市某中药店。槲皮素与芸香苷标准品均购于中国食品药品检定研究院。DPPH购于梯希爱（上海）化成公司；无水乙醇、氯化铝、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、维生素C等药品均为分析纯试剂，购自国药集团化学试剂公司。RE52-99旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；AR124CN电子分析天平（美国奥豪斯公司）；超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物科技有限公司）；UV-1750紫外可见光分光光度计（日本岛津公司）；MultiskanGO全波长酶标仪（美国Thermo公司）；ZWY-2102C全温摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）；万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）。 　　1.2样品溶液的制备 　　用粉碎机将大血藤药材充分粉碎，准确称取药材粉末0.5g，置于烧杯中，加入60%乙醇50mL，封口后放入全温摇床120r/min60℃振荡浸提24h。浸提结束后超声破碎提取30min，超声破碎程序设定为超声15s，间歇15s，超声频率40Hz，功率1000W。超声结束后抽滤取过滤液，用60%乙醇定容至50mL，得到10g/L样品溶液。 　　1.3黄酮标准品溶液的配制 　　称取芸香苷、槲皮素标准品各5mg，分别置于50mL容量瓶中，加适量无水乙醇将其完全溶解，纯水定容，得到0.1mg/mL芸香苷标准液、槲皮素标准液。 　　1.4黄酮3种定量测定方法 　　1.4.1直接测定法分别取大血藤提取物溶液、芸香苷标准液、槲皮素标准液，用紫外分光光计在300～800nm波长范围内进行光谱扫描，60%乙醇作基线处理，记录吸光度。 　　1.4.2三氯化铝法分别取1mL大血藤提取物溶液、芸香苷标准液、槲皮素标准液，加入3支10mL具刻度试管中，依次加入1mL0.1mol/LAlCl3溶液及1mLpH值为5.5的醋酸钠-醋酸缓冲液，用60%乙醇定容至刻度，在300～800nm波长范围内进行光谱扫描，60%乙醇同样显色后作扫描基线，记录吸光度。 　　1.4.3亚硝酸钠-硝酸铝法分别取1mL大血藤提取物溶液、芸香苷标准液、槲皮素标准液，加入3支10mL具刻度试管中，加60%乙醇定容至5mL，加5%NaNO2溶液300μL，静置6min后加入10%Al（NO3）3溶液300μL，静置6min后再加入4mL1.0mol/LNaOH溶液，最后用60%乙醇定容至10mL，30℃水浴静置20min，在300～800nm波长范围内进行光谱扫描，60%乙醇加显色剂管作扫描基线，记录吸光度。 　　1.5亚硝酸钠-硝酸铝显色法考察 　　根据以上3种方法的光谱扫描结果，筛选出合适的标准品为芸香苷，采用亚硝酸钠-硝酸铝法显色进行试验。 　　1.5.1标准曲线绘制分别取芸香苷标准液0、