凡纳滨对虾Toll2与血蓝蛋白相互作用的研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

摘要 我国是对虾养殖大国，但随着对虾养殖业的迅猛发展，养殖过程中爆发的细菌性疾 病和病毒性疾病给对虾产业造成了巨大损失，病害防控成为制约对虾养殖业可持续发展 的关键因素。鉴于此，学者们普遍认为积极研究对虾自身免疫机制，深入了解对虾免疫 调控网络，是解决目前对虾养殖疾病的有效途径之一。近年来，人们发现 Toll 是对虾体 内的一种重要的病原相关分子模式受体，但迄今为止，其与其它免疫分子的相互作用及 其免疫调控网络等尚不清楚。有趣的是，本课题组前期采用免疫共沉淀和质谱的方法， 初步发现凡纳滨对虾 Toll 蛋白与血蓝蛋白（hemocyanin，HMC）可能存在相互作用。为 此，本研究在此基础上，采用分子生物学技术和蛋白质组学策略对凡纳滨对虾 Toll2 与 HMC 的相互作用展开了进一步的研究，所获主要研究结果如下： 首先，采用基因克隆和原核表达技术，对凡纳滨对虾 Toll2 进行基因克隆与原核表 达， 成功获得了 Toll2 重组子（ pET-32a-Toll2 ）及其原核表达蛋白（ Toll2 ）， 并通过 MALDI-TOF-TOF 质谱鉴定，确认该重组表达蛋白为凡纳滨对虾 Toll2 蛋白。 继而，在上述研究基础上，采用免疫接种技术制备鼠抗虾 Toll2 多克隆抗体，经 Dot- ELISA 和 Western-blotting 验证，鼠抗虾 Toll2 抗血清可以与 Toll2 重组蛋白发生特异性的 结合。正向 Far-Western-blotting 实验表明， Toll2 蛋白与 HMC 孵育后，其可与抗 HMC 抗 体呈明显的阳性；反向 Far-Western-blotting 分析显示，HMC 与 Toll2 蛋白孵育后，其同样 可与抗 Toll2 抗体发生特异性的结合。由此说明，Toll2 蛋白确实可以与 HMC 发生相互作 用。 最后，运用病原刺激、实时定量 PCR、RNA 干扰等实验技术分析 HMC 对 Toll2 及其 信号传导途径的影响。结果发现，乙型链球菌和副溶血弧菌刺激对虾后， Toll2 与 HMC 的 mRNA 表达变化呈明显的正相关性，二者的表达均呈现先上升后下降的表达模式，且 二者均在刺激后 24h 时表达量达到最高。进一步研究显示，对虾 HMC 被干扰后，Toll2 及其信号传导途径效应基因抗菌肽 Penaeidin-4 的 mRNA 表达水平受到显著性的影响，其 中，乙型链球菌刺激对虾 12、24h 后，Toll2 的 mRNA 表达水平分别为 HMC 被干扰前的 13.6 、50.3 %，具有极显著性和显著性差异。同样，Penaeidin-4 在 12、48 和 72 h 时的 mRNA 表达水平分别为 HMC 被干扰前的 14.2、32.1 和 26.3%，具有极显著性、显著性和 1 显著性差异。此外，在副溶血弧菌刺激对虾后，Toll2 和 Penaeidin-4 的 mRNA 表达水平与 HMC 被干扰前相比，同样发生了较大幅度的下降。由此推测，HMC 应该对 Toll2 及其信 号传导途径效应基因具有一定的正调控作用。 综上所述，本研究首次发现 Toll2 蛋白可以与 HMC 发生相互作用, 且 HMC 对 Toll2 及其信号传导途径效应基因表现出较好的正调控作用。所获研究结果为深入探索对虾 Toll2 的免疫调控网络奠定了良好的基础，对促进对虾养殖业的可持续、健康发展具有重 要意义。 关键词：凡纳滨对虾； Toll2 蛋白；血蓝蛋白；相互作用；免疫学意义 2 Abstract Shrimp culture has become one of the most important aquaculture industries in our country. However, recently shrimp farms have suffered from dramatic decreases in production due to infectious diseases, mainly of bacterial and viral etiology. Researchers suggested that investigation of defense mechanisms and understanding of the immune regulation network of shrimp will be very helpful to establish ecological prevention strategies for shrimp disease control. Toll is one of the most important pattern recog