凡纳滨对虾血蓝蛋白抗肿瘤活性及其功能多样性的糖分子基础研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

摘要 对虾血蓝蛋白是近年来发现的一种与对虾免疫防御有关的多功能蛋白，其具有酚氧化 酶活性、抗病毒、抗细菌、凝集、溶血等多种非特异性免疫学活性。然而迄今为止，其是 否具有抗肿瘤活性尚不清楚，同时其功能多样性的糖分子基础还有待于进一步深入研究。 为此，本研究在探索对虾血蓝蛋白抗肿瘤活性及其分子作用机制的基础之上，对其功能多 样性的糖分子基础进行了较深入的研究，所获研究结果具体如下： 1、对虾血蓝蛋白抗肿瘤活性及其分子机制研究 首先，采用 SRB 和 MTT 两种方法探索对虾血蓝蛋白对 Hela 细胞的抗肿瘤活性。结 果发现，10-50 μg/mL 蓝蛋白处理 Hela 细胞 48 h 后，血蓝蛋白对 Hela 细胞的抑制率 56.87-71.35％，而对正常的 293T 细胞无抑制活性，且对肿瘤细胞的抑制活性随着血蓝蛋 白浓度的上升，对 Hela 细胞的抑制率逐渐提高，呈明显的浓度-剂量效应，由此说明，对 虾血蓝蛋白具有抗肿瘤活性。 继而，采用显微镜观察和 Dapi 染色技术分析血蓝蛋白对 Hela 细胞和正常细胞形态和 细胞核的影响，结果表明，血蓝蛋白能够使 Hela 细胞皱缩、变圆并产生类似阳性对照的 凋亡小体，而对正常的 293T 细胞没有影响。提示，血蓝蛋白可能诱导了 Hela 细胞的凋亡。 接着，采用细胞免疫荧光和 DNA ladder 实验技术分析血蓝蛋白与 Hela 细胞的相互作 用以及血蓝蛋白对 Hela 细胞核基因组的影响，结果发现，血蓝蛋白能够与细胞膜相互结 合并（或者）能进入细胞内部，并能使细胞核基因组在 100bp 和 300bp 左右产生梯状条带， 进一步表明血蓝蛋白可能诱导了 Hela 细胞的凋亡。 然后，我们采用蛋白质组学的策略鉴定对虾血蓝蛋白作用 Hela 细胞后主要变化蛋白。 结果显示，与对照组相比，17 个蛋白点表达水平发生明显的变化，其中 11 个蛋白表达上 调，6 个蛋白表达下调，经 MALDI-TOF-TOF/MS 分析和 Mascot 搜索, 蛋白点 1、3、4、5、 8、11、13、15、16、17 等 10 个显著差异的蛋白点分别鉴定为 Edar 相关死亡受体、Hsp60 变体、Hsp70 前体、YWHAZ 蛋白和 GTP 结合蛋白 Ran 等蛋白点，说明这些蛋白可能与 Hela 细胞凋亡密切相关。 最后，我们随机挑选 Hsp60， Hsp70 前体， 14-3-3 蛋白 ζ/δ， Hsp90， GTP 结合蛋 白 Ran 等 5 个蛋白采用荧光定量-PCR 的方法，分析它们在转录水平上的变化。结果表明， mRNA 和蛋白水平的表达基本一致，与对照组相比，Hsp70 前体， 14-3-3 蛋白 ζ/δ， Hsp90， GTP 四个蛋白在 mRNA 水平上的表达具有显著性差异。 I 结合上述质谱的结果以及国内外相关研究进展，我们推测血蓝蛋白抑制 Hela 细胞生 长的机制可能为：对虾血蓝蛋白以某种方式进入 Hela 细胞内部后，通过产生活性氧或醌 类物质诱导肿瘤细胞以细胞程序性凋亡或细胞自噬凋亡机制抑制肿瘤细胞生长。 2、对虾血蓝蛋白糖分子基础的研究 首先，采用亲和层析、凝集素层析的方法纯化对虾血蓝蛋白：HMC-C、HMC-NC。糖 含量显示，HMC-C、HMC-NC 糖含量分别为 3.19％.和 0.15％，前者为后者的 22 倍；糖印 迹结果表明，与 HMC-NC 相比，HMC-C 是高甘露糖（葡萄糖）基化程度较高。HPLC 分 析发现，胰酶消化后 HMC-C、HMC-NC 在 HPLC 图谱分别表现为 54、42 个峰，尤其是 两者胰酶水解的肽段再次经 ConA 凝集素柱纯化，前者在 HPLC 图谱上表现为 49 个峰，而 后者仅为 6 个峰。由此说明，凝集素层析分离纯化所得的两种血蓝蛋白在糖基修饰方面存 在较大差异。 继而，对采用玻片凝集技术对该两种血蓝蛋白的免疫学功能进行对比分析。结果显示， HMC-C 在溶藻酸弧菌和河弧菌凝集活性、鸡血细胞和人细胞的细胞凝血活性以及对鸡血 细胞溶血活性上均明显强于 HMC-NC，其中，对溶藻弧菌的凝集活性前者为后者的 8 倍； 对鸡红细胞的凝血活性 HMC-C 为 HMC-NC 的 4 倍。结合本课题组最近发现的 5 种糖含量 不同的对虾血蓝蛋白的功能对比分析的结果，我们推测血蓝蛋白发挥多种免疫学功能应该 与其糖基修饰有关，即血蓝蛋白的糖基化修饰可能是其功能多样性的分子基础之一。 综上所述，对虾血蓝蛋白同样具有抗肿瘤活性，糖基化修饰可能为其功能多样性的分 子基础之一。所获研究结果为彻底揭示血蓝蛋白的免疫学活性及其功能多样性的糖分子作 用基础奠定了良好的基础，并对血蓝蛋白潜在的临床应用前景提供了较好的科学依据。 关键词：对虾；血蓝蛋白；抗肿