发酵与分离耦合高强度生产L-乳酸的研究-生物制药工程专业论文.docx

摘 要 L-乳酸是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、医药和化工领域，作为合成可 生物降解、环境友好新材料—聚乳酸（PLA）的主要原料，L-乳酸应用前景极其光明。 目前存在着原料成本较高、发酵周期较长产率较低、发酵过程能耗和三废排放量较 大等问题，导致 L-乳酸生产成本居高不下，成为制约 L-乳酸产业发展的瓶颈。为解 决上述问题，本研究采用廉价的盾叶薯蓣为原料，实行分段控制培养条件和细胞回 流高强度发酵，大幅提高 L-乳酸产量和生产率，同时清洁联产副产物薯蓣皂苷元， 增加原料附加值，力争多途径降低 L-乳酸发酵生产成本。 （1）从自然界筛选出一株高光学纯度 L-乳酸产生菌 Lactobacillus rhamnosus HG09，以该菌株为出发菌株，先进行紫外线联合诱变剂的复合诱变，再进行 5 轮递 推式原生质体融合（Genome shuffling），最终筛选出 1 株遗传性能稳定的正向突变株 L.rhamnosus HG09F5-27，在含 160g/L 的盾叶薯蓣淀粉酶解糖和 0.35mol/L 薯蓣皂苷 的培养基中，L-乳酸产量达到 141.33±4.11g/L，生产率达到 1.76±0.04g/L/h，分别是 出发菌株的 4.09 和 4.40 倍，为高强度发酵奠定了菌种基础。 （2）为不与人争粮，筛选出非粮原料——盾叶薯蓣淀粉为 L-乳酸发酵生产碳源， 以替代较为昂贵的玉米淀粉碳源，从农副产品中筛选出廉价高效的麸皮水解液替代 玉米浆等作为氮源，选择罗田甜柿汁替代极为昂贵的酵母粉提供生长因子，并采用 析因实验和响应面法优化培养基，获得最大 L-乳酸产量 144.28±2.71g/L，其对应的 麸皮水解液和甜柿汁用量分别为比优化前节约了 0.75%和 16.00%。 （3）建立了以盾叶薯蓣淀粉酶解糖液为底物的L.rhamnosus HG09F5-27的单批发 酵动力学模型方程，发现L-乳酸产量、糖酸转化率和最大比生长速率( μmax) 随培养基 初糖浓度的升高而降低；研究了几种常用中和剂解除发酵产物抑制的效果，发现 Ca(OH)2 调节pH能力较为理想；确立了不同发酵阶段pH、温度和通风等培养条件的 分段控制策略，L-乳酸产量和生产率分别达到151.27±3.15g/L和2.70±0.06g/L/h，分别 比恒定条件发酵提高5.57%和32.35%。 （4）采用 100 L 规模的外循环式膜生物反应器，实现细胞回流式半连续发酵生 产 L-乳酸；发现脉冲补料能有效解除底物抑制，生产率比不补料提高了 32.07%；在 细胞循环发酵中，第 N 轮发酵末期活细胞数目愈多，第 N+1 轮发酵 L-乳酸产量和生 产率就越大；采用脉冲补料及细胞回流发酵，随着发酵轮次的增加生物量缓慢上升， L-乳酸产量、生产率及糖酸转化率先升后降，第 8 轮 L-乳酸产量达到 157.26±3.06g/L， 比单批发酵提高了 12.89%，生产率达到 8.73±0.17g/L/h，是单批发酵的 4.11 倍，大 大降低了能耗； （5）为获得 L-乳酸发酵副产物——薯蓣皂苷元，采用蒸汽爆破及多种酶水解联 合预处理盾叶薯蓣原料，使 90%以上的薯蓣皂苷分配到糖液中；随后进行发酵与分 离耦合的 L-乳酸生产，采用纳滤浓缩发酵液，富集薯蓣皂苷，使薯蓣皂苷元的得率 达到 2.21±0.13g/100g，比传统酸水解法提高了 6.76%，而废水和废渣排放量减少了 95%以上，实现了盾叶薯蓣皂苷元生产的源头治理污染。 本研究的创新点包括：通过传统物理化学复合诱变结合原生质体融合技术，选 育出一株耐 L-乳酸盐和薯蓣皂苷的正向突变菌株，L-乳酸光学纯度大于 98%，产量 和生产率分别是出发菌株的 4.09 和 4.40 倍；筛选出一种可用于 L-乳酸发酵的新非粮 原料——盾叶薯蓣，使 L-乳酸生产原料成本间接降低至玉米原料的 1/2；采用脉冲补 料和细胞回流发酵技术，使 L-乳酸发酵生产半连续进行 12 轮次，与单批发酵相比， L-乳酸产量提高 12.89%，生产率提高 3 倍；采用二级发酵与多级膜分离耦合技术， 使 L-乳酸生产废水和废渣排放量分别只有传统钙盐法的 1/5 和 1/4，同时实现了 L- 乳酸的副产品——薯蓣皂苷元的清洁生产，其得率比传统酸水解法提高了 6.76%，硫 酸用量、废水和废渣排放减少 95%以上，实现了节能减排的目标。 本研究提供的发酵与膜分离耦合系统和技术，有可能同样适用于以其它杆状、 球状细菌或酵母菌等微生物为生产菌的发酵生产，筛选出的盾叶薯蓣原料有可能同 样适用于琥珀酸和乙醇等产品的发酵生产。本研究为利用一种非粮原料联产多个产 品提供了方法学借鉴。 关键词：盾叶薯蓣 L-乳酸 薯蓣皂苷元 高生产率发酵 节能减排 Abstract L