二硫键对人朊蛋白生化特性和功能的影响-生态学专业论文.docxVIP

保护知识产权声明 本人为申请河北大学学位所提交 的题目为 (二百丸悦乏对1(礼向生化将愧 和工作自挂钩穿 )l队 的学位论文 ，是我个人在导师( 刽走以 )指导并与导师合作下取得的研究成果 ， 研究工作及取得的 研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费 资助下完成的。本人完全了解并严格遵守中华人民 共和国为保护知识产权所制定 的各项法律、行政法规以及河北大学的相关规定。 本人声明如下:本论文的成果归河 北大学所有， 未经征得指导教师和河北大 学的书面同意和授权，本人保证不以任何形式公 开和传播科研成果和科研工作 内 容。如果违反本声明 ，本人愿意承担相应法律责任。 声明人 : J r:$ 日期: 一旦L年一二月_f 一日 作者签名 : 班路 导师签名: 川县以 日期:Jtf三年一 6 月 日 日期:一旦三年一生一月 g 日 摘 要 本研究主要围绕二硫键在人朊病毒蛋白分子 huPrP23-231 中的作用展开，首先通过 体外对纯化的原核重组人正常朊蛋白硫醇基团的氧化还原过程，测定二硫键的改变对其 生化特性的影响；进而探究了 N 端八肽重复区序列对二硫键形成的硫醇基团的氧化还原 过程介导的聚集和纤维化的敏感性，最后进行了部分二硫键相关突变体质粒的构建，和 真核细胞转染。蛋白沉淀实验显示重组正常人朊病毒蛋白经过硫醇基团的氧化还原过程 明显增加了其聚集性，而八肽重复区缺失和插入型突变体蛋白则没有明显变化；硫磺素 T(Thioflavin T ，ThT)实验测定发现，经过硫醇基团的氧化还原过程重组 PrP 蛋白的纤 维形成增多，同样的八肽重复区突变体蛋白无明显变化；圆二色谱（Circular Dichroism, CD）测定显示，处理后的重组 PrP 蛋白二级结构发生改变，其 β-折叠结构比例显著增 多，八肽重复区突变体蛋白的 β-折叠则减少；蛋白酶 K 消化实验也进一步显示硫醇基 团的氧化还原后 PrP 的蛋白酶 K 抵抗能力有所增加，而八肽重复区突变体蛋白的蛋白酶 K 抗性增加更明显。这些结果提示二硫键的形成可明显地改变 PrP 的二级结构，促进朊 蛋白聚集和成纤维过程，而且正常的 5 个八肽重复区序列对蛋白稳定的构象转变是必需 的。为进一步研究二硫键的作用，构建了二硫键相关的突变体质粒 pQE30-C214G、 pQE30-C179G/C214G、pQE30-M166C/E221C，并进行了测序和酶切鉴定。正在进行的 和后续实验准备通过原核表达、纯化并进行硫醇基团的氧化还原过程，进行上述参数测 定；并且在真核细胞中转染构建的二硫键相关突变质粒 pcDNA3.1-C179G/C214G、 pcDNA3.1-M166C/E221C，测定可能引起的细胞毒性和细胞保护作用。 关键词 朊蛋白 氧化还原 纤维化 β-折叠 点突变 Abstract This thesis is focused on roles of disulfide bond in properties of human prion protein. Firstly, the expressed recombinant human wild-type PrP protein was purified for using in an established redox process for the reduction and oxidation of the ethanethiol group within PrP. Then we tested susceptibilities of N-termi octapeptide repeat mutant protein to fibrillization and aggregation induced by formation of disulfide bond. Sedimentation tests illustrated that redox process remarkably promoted the aggregation of recombinant PrP, but not the deletion and insertion octapeptide mutants. Thioflavin T binding assay revealed an enhanced fibrillization of the recombinant human PrP after redox process, but not a significant difference for mutants. Far-UV circular dichroism demonstrated t