二硫键对胰岛素聚集性的影响-药理学专业论文.docxVIP

二硫键对胰岛素聚集性的影响 2010 级硕士研究生 黎阳 指导老师 黄昆（教授） 华中科技大学同济医学院药学院生物药学系 摘要 研究背景：蛋白可以发生聚集而形成淀粉样纤维。蛋白的聚集和一些疾病的 发生有关，如阿尔兹海默病和帕金森病。蛋白的聚集与一系列因素有关，包括二 硫键。一般认为，在维持蛋白质的结构稳定以及折叠的过程中，二硫键起重要作 用。实验目的：胰岛素分子由两条多肽链组成，含有三对二硫键（两对链间二硫 键 A7-B7、A20-B19 及一对链内二硫键 A6-A11）。本研究中，我们以胰岛素作为 模式蛋白，研究逐个二硫键对胰岛素聚集的影响。实验方法：使用三(2-羧乙基) 膦（TCEP）作为还原剂来分别还原猪胰岛素（PI）三对二硫键中的两对二硫键， 并将还原的到的巯基用碘乙酰胺进行烷基化。获得三种化学性质稳定的胰岛素类 似物：INS-2（缺失 A6-A11），INS-3（缺失 A7-B7），INS-6（同时缺失 A6-A11 和 A7-B7）。远紫外-圆二色光谱的结果显示：在中性 pH 下，INS-2 的结构与 PI 的结构最接近，其次是 INS-3 和 INS-6；在酸性 pH 下，三种异构体的结构大都 呈无规则卷曲状态。我们还用硫磺素 T（ThT）荧光法和电子显微镜（TEM）检 测了二硫键缺失的 PI 异构体的聚集性。实验结果：结果显示，三种异构体的聚 集性相对于胰岛素都有所增加，其聚集性从高到低依次为：INS-6 INS-3 INS-2。光交联法显示，二硫键 A6-A11 缺失的胰岛素类似物（INS-2 和 INS-6） 比 A6-A11 完好的类似物（INS-3）更容易形成寡聚体，从而对人的红细胞产生 更强的破坏作用。结论：二硫键 A7-B7 的缺失更容易导致 PI 结构的变化，增加 聚集性；二硫键 A6-A11 的缺失能够增强 PI 的寡聚体化，导致毒性增加。 关键词：胰岛素、二硫键、淀粉样纤维、寡聚体化 Abstract Master Student: Li Yang Supervisor: Prof. Huang Kun Department of Biopharmacy, Tongji School of Phamarmarcy Huazhong University of Science and Technology Disulfide bonds play critical role in the stability and folding of proteins. Here, we used insulin as a model system, to investigate the role of its individual disulfide bond during the amyloid formation of insulin. Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) was applied to reduce two of the three disulfide bonds in porcine insulin and the reduced disulfide bonds were then alkylated by iodoacetamide. Three disulfide bond-modified insulin analogues, INS-2 (lack of A6-A11), INS-3 (lack of A7-B7) and INS-6 (lack of both A6-A11 and A7-B7), were obtained. Far-UV circular dichroism (CD) spectroscopy results suggested the secondary structure of INS-2 was the closest to insulin under neutral condition, followed by INS-3 and INS-6, whereas in acid solution most analogues were essentially unfolded. To test how these modifications affect the amyloidogenecity of insulin, thioflavin-T (ThT) fluorescence, transmission electronic microscopy (TEM) were performed. Our results suggested that all analogues were more pro