凡纳滨对虾翻译控制肿瘤蛋白基因的克隆及其在对虾原代培养细胞中的表达研究-生物工程专业论文.docxVIP

凡纳滨对虾翻译控制肿瘤蛋白基因的克隆及其在对虾原代培养细胞中的表达研究-生物工程专业论文.docx

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凡纳滨对虾翻译控制肿瘤蛋白基因的克隆及其在对虾原代培养细胞中的表达研究-生物工程专业论文

独 创 声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其 它人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含未获得或其它教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名: 签字日期: 年 月 日 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,并同意以下 事项: 1、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许 论文被查阅和借阅。 2、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中 国学术期刊(光盘版)电子杂志社”用于出版和编入 CNKI《中国知识资源总库》, 授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名: 导师签字: 签字日期: 年 月 日 签字日期: 年 月 日 凡纳滨对虾翻译控制肿瘤蛋白基因的克隆及其在对虾原代 培养细胞中的表达研究 摘 要 尽管国内外学者们在对虾细胞建系上进行了大量的探索和不懈的努力,但对 虾细胞培养技术目前仍处于原代培养水平,永生性细胞系一直未成功建立。而对 虾永生性细胞系的建立对于研究对虾病毒的致病机理和制备病毒疫苗等具有重 要科学意义。在哺乳动物细胞中,致癌基因的过表达可成功实现细胞的永生性转 化。翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)是一种重要的细胞生长相关蛋白,具有促进细 胞生长、抗凋亡和重编程作用。因此,本文拟克隆凡纳滨对虾的 TCTP 基因,构 建真核表达载体,并通过脂质体法将其转染到对虾原代培养细胞中,过表达,分 析其在对虾细胞的永生性转化中的作用,为对虾细胞的永生性转化奠定技术基 础。 本文首先通过 RT-PCR 技术成功克隆得到凡纳滨对虾 TCTP 基因编码框的 cDNA 全长,长度为 507 bp,编码 168 个氨基酸。以报告质粒 pCX-eGFP 为模板, PCR 扩增得到加强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因编码框。然后,以 BamHI 和 EcoRI 双酶切将 TCTP 基因定向插入真核表达质粒 pcDNA3.1/V5-HisA,构建得 到 pcDNA3.1-TCTP 重组质粒;以 KpnI 和 BamHI 双酶切将 eGFP 基因定向插入 到 pcDNA3.1-TCTP 重 组 质 粒 , 构 建 得 到 eGFP 融 合 蛋 白 表 达 载 体 质 粒 pcDNA3.1-eGFP/TCTP。 通过脂质体法将融合蛋白表达载体质粒 pcDNA3.1-eGFP/TCTP 转染到哺乳 动物细胞(Plat-GP)中,24 小时后在荧光显微镜下可观察到明显的绿色荧光表 达,表明所构建表达质粒在 Plat-GP 细胞中可有效表达。但是,通过脂质体法将 该表达质粒转染到凡纳滨对虾类淋巴组织的原代培养细胞中,在荧光显微镜下却 观察不到绿色荧光,表明该表达质粒在对虾细胞中不能有效表达。提取 96 小时 转染后对虾原代培养细胞的基因组 DNA 和总 RNA,以 eGFP 特异性引物为引物, PCR 检测 eGFP 基因的导入和表达情况。发现,以基因组 DNA 为模板可以扩增 出 eGFP 特异性片段,但是以总 RNA 反转录得到的 cDNA 为模板却不能扩增出 eGFP 特异性片段。这表明,所转染表达质粒 pcDNA3.1-eGFP/TCTP 已成功导入 I 对虾细胞,但没有成功转录,因而导致所转染对虾细胞中没有绿色荧光表达。 表达质粒 pcDNA3.1-eGFP/TCTP 的启动子为细胞肥大病毒启动子(CMV), 该表达质粒的以上转染实验表明,CMV 在哺乳动物细胞中为强启动子,但是在 对虾细胞中却不能有效驱动基因的表达。因此,本文随后又克隆了凡纳滨对虾 TCTP 基因启动子(Ptctp),并将其插入表达质粒 pcDNA3.1-eGFP/TCTP 中,分析 了该启动子在对虾细胞中的转录活性。所克隆启动子 Ptctp 的长度为 605 bp,位于 TCTP 基因编码区上游-13 至-617 bp 处,通过 KpnI 和 BamHI 双酶切将该启动子 插入载体 pcDNA3.1-eGFP/TCTP 中 CMV 之后,eGFP 基因之前,构建得到表达 载体 pcDNA3.1-Ptctp-eGFP/TCTP。然后通过脂质体

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