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凡纳滨对虾翻译控制肿瘤蛋白基因的克隆及其在对虾原代培养细胞中的表达研究-生物工程专业论文
独 创 声 明
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学位论文作者签名: 签字日期: 年 月 日
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凡纳滨对虾翻译控制肿瘤蛋白基因的克隆及其在对虾原代
培养细胞中的表达研究 摘 要
尽管国内外学者们在对虾细胞建系上进行了大量的探索和不懈的努力,但对 虾细胞培养技术目前仍处于原代培养水平,永生性细胞系一直未成功建立。而对 虾永生性细胞系的建立对于研究对虾病毒的致病机理和制备病毒疫苗等具有重 要科学意义。在哺乳动物细胞中,致癌基因的过表达可成功实现细胞的永生性转 化。翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)是一种重要的细胞生长相关蛋白,具有促进细 胞生长、抗凋亡和重编程作用。因此,本文拟克隆凡纳滨对虾的 TCTP 基因,构 建真核表达载体,并通过脂质体法将其转染到对虾原代培养细胞中,过表达,分 析其在对虾细胞的永生性转化中的作用,为对虾细胞的永生性转化奠定技术基 础。
本文首先通过 RT-PCR 技术成功克隆得到凡纳滨对虾 TCTP 基因编码框的 cDNA 全长,长度为 507 bp,编码 168 个氨基酸。以报告质粒 pCX-eGFP 为模板, PCR 扩增得到加强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因编码框。然后,以 BamHI 和 EcoRI 双酶切将 TCTP 基因定向插入真核表达质粒 pcDNA3.1/V5-HisA,构建得 到 pcDNA3.1-TCTP 重组质粒;以 KpnI 和 BamHI 双酶切将 eGFP 基因定向插入 到 pcDNA3.1-TCTP 重 组 质 粒 , 构 建 得 到 eGFP 融 合 蛋 白 表 达 载 体 质 粒 pcDNA3.1-eGFP/TCTP。
通过脂质体法将融合蛋白表达载体质粒 pcDNA3.1-eGFP/TCTP 转染到哺乳 动物细胞(Plat-GP)中,24 小时后在荧光显微镜下可观察到明显的绿色荧光表 达,表明所构建表达质粒在 Plat-GP 细胞中可有效表达。但是,通过脂质体法将 该表达质粒转染到凡纳滨对虾类淋巴组织的原代培养细胞中,在荧光显微镜下却 观察不到绿色荧光,表明该表达质粒在对虾细胞中不能有效表达。提取 96 小时 转染后对虾原代培养细胞的基因组 DNA 和总 RNA,以 eGFP 特异性引物为引物, PCR 检测 eGFP 基因的导入和表达情况。发现,以基因组 DNA 为模板可以扩增 出 eGFP 特异性片段,但是以总 RNA 反转录得到的 cDNA 为模板却不能扩增出 eGFP 特异性片段。这表明,所转染表达质粒 pcDNA3.1-eGFP/TCTP 已成功导入
I
对虾细胞,但没有成功转录,因而导致所转染对虾细胞中没有绿色荧光表达。
表达质粒 pcDNA3.1-eGFP/TCTP 的启动子为细胞肥大病毒启动子(CMV), 该表达质粒的以上转染实验表明,CMV 在哺乳动物细胞中为强启动子,但是在 对虾细胞中却不能有效驱动基因的表达。因此,本文随后又克隆了凡纳滨对虾 TCTP 基因启动子(Ptctp),并将其插入表达质粒 pcDNA3.1-eGFP/TCTP 中,分析 了该启动子在对虾细胞中的转录活性。所克隆启动子 Ptctp 的长度为 605 bp,位于 TCTP 基因编码区上游-13 至-617 bp 处,通过 KpnI 和 BamHI 双酶切将该启动子 插入载体 pcDNA3.1-eGFP/TCTP 中 CMV 之后,eGFP 基因之前,构建得到表达 载体 pcDNA3.1-Ptctp-eGFP/TCTP。然后通过脂质体
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