基于正交实验优化创伤弧菌金属蛋白酶融合蛋白的表达..docVIP

基于正交实验优化创伤弧菌金属蛋白酶融合蛋白的表达 】目的：对创伤弧菌金属蛋白酶融合蛋白表迗 条件进行优化，从而获得高效稳定的金属蛋白酶原核表达系 统。方法：质粒pET_32a-vvp转化/DE3后，针对诱导过程中 对工程菌表达蛋白产生影响的4个因素诱导时间、诱导温度、 诱导剂浓度以及诱导时摇菌的转数，运用统计学软件进行正 交实验设计，对结果进行直观分析及方差分析，并对实验得 出的最佳搭配诱导条件进行验证。结果：直观分析表明摇菌 转数的R值最大，其次为诱导时间和诱导温度，诱导剂IPTG 浓度的R值最小；方差分析表明摇菌转数的P值小于，而时 间因素、温度及IPTG浓度的P值均大于。结论：摇菌转数 为主要因素，其次为诱导时间，而诱导温度和诱导剂IPTG 浓度对实验结果影响不明显。本实验的最佳搭配诱导条件为 摇菌转数250r/m、诱导时间4h、诱导温度37°C、诱导剂IPTG 浓度lmmol/L。在此诱导条件下，金属蛋白酶的表迗量高迗％。 关键词】创伤弧菌；金属蛋白酶；正交设计；直观 分析；方差分析 onofrecombinantmetriovulnificusin/DE thod： TheplasmidofAbstr act Objective： Too ptimizetheexpressi alloproteaseofVvib 3inducedbyIPTG. Me pET-32a-vvp/wascon onofrecombinantmet riovulnificusin/DE thod： Theplasmidof struetedbyourlabor ntfactors,includin agitationspeedandconcentrationofIPTGogonalexperimental eanalyzedbydirectcmethod. Results： Tatory. Fourdiffere gtime,temperature,,werestudiedbyorth design. Thedatawer struetedbyourlabor ntfactors,includin agitationspeedandc oncentrationofIPTG ogonalexperimental eanalyzedbydirectc method. Results： T atory. Fourdiffere gtime,temperature, ,werestudiedbyorth design. Thedatawer alculationandANOVA heRvalueofagitatio nrateresultingfrom ashighestamongfour ofagitationratewas eoftheotherfactors elusions： Theexpre ableaffectedbythea xpressionlevelofVV henagitationrateis ehaveestablishedam directcalculationw factors. ThePvalue lowerthan ThePvalu werehigherthan Con ssionlevelisremark gitationrate. Thee PprotEinishighestw 250rpm. Thereforew ethodforhigh-level expressionofVVP-fo urhours-inducingti me,37 °C -inducingtem perature,lmmol/Lco ncentrationofIPTGa ibriovulnificus； mndagitationratein2 50rpm. Keywords v ibriovulnificus； m etalloprotease； or thogonalexperiment aldesign； directana lysis； analysisofva riance (ANOVA) 很多临床病例及动物实验已经证明，进食被创伤弧菌污 染的食物或者皮肤破损接触Vv均可引起Vv感染，主要表现 为严重的蜂窝组织炎和败血症［广3］。一旦出现败血症，其 死亡率高达50%以上［4~6 ］。因其病情凶险，故对创伤弧菌 感染的临床早期快速诊断尤为重要。目前，Vv的致病机制尚 未明了。但有研究表明该菌分泌的金属蛋白酶具有增加血管 通透性，引起出血性损伤的作用，已被证实是创伤弧菌的主 要毒力因素之一 ［7~9］，并且vvp基因在不同创伤弧菌菌株 之间具有高度保守性。故金属蛋白酶可作为创伤弧菌感染重 要的临床实验室检测靶标。而要制备以VVP