间充质细胞点种法移植修复关节软骨缺损的研究.docVIP

间充质细胞点种法移植修复关节软骨缺损的研究 　　摘要：目的 探讨自体骨髓间充质细胞移植修复关节软骨缺损的可行性。[方法] 将30只新西兰纯种兔共60个膝关节随机分为3组：骨髓间充质细胞点种法移植组、单纯骨膜点种法移植组和空白对照组。分别于术后2、4、12、24周取标本行大体、光镜、电镜的组织学动态观察，并同时对修复组织进行组织学和组织化学质量评估，观察自体骨髓间充质细胞移植术修复软骨缺损的效果。[结果] 二移植组均能获得软骨样修复，而对照组缺损区仅为纤维组织填充，并且骨髓间充质细胞加骨膜移植组兔各期平均组织学和组织化学得分均高于其它两组（P0.01），而骨膜移植组后期得分也明显高于对照组（P0.05）。[结论]骨髓间充质细胞在点种移植后能获得透明软骨样修复，且明显优于单纯的骨膜移植术。 　　关健词：骨髓间充质细胞；关节软骨缺损；修复；点种移植术 　　关节软骨因其再生能力有限，目前临床上还没有满意的修复关节软骨缺损的方法。而软骨种子细胞来源有限，体外不能大量扩增以及扩增后容易老化等问题，已成为软骨组织工程进一步发展的瓶颈之一，为此我们设计出一种新的方法，通过骨髓间充质细胞移植，以期获得透明软骨修复。 　　1 材料和方法 　　实验动物与分组：健康新西兰纯种成熟兔30只共60个膝关节，分成3组：骨髓间充质细胞加骨膜移植组（20个）；单纯骨膜移植组（20个）；对照组（20个）。 　　骨髓间充质细胞的分离、纯化和培养：穿刺新西兰兔双侧股骨抽取骨髓， 用密度梯度离心法从中分离出单个核细胞，贴壁法分离培养骨髓间充质细胞， 每隔5 d去除非贴壁细胞， 待细胞达到75%左右融合密度时消化传代，直至二周，同时每只兔的骨髓间充质细胞进行编号。 　　移植方法：30只实验兔用3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）行静脉麻醉后，无菌操作下行膝内侧切口，逐层切开达关节腔，将髌骨导向外侧脱位，显露股骨髁关节面，于髌骨沟处，用利刀片作6 mm×4 mm大小的全层关节软骨缺损，肉眼见缺损处无软骨组织残余后。骨髓间充质细胞加骨膜移植组兔先行缺损的关节面上缝合一层自体胫骨骨膜，与周围软组织缝合，生发层朝关节腔，然后穿透被移植的骨膜向关节面缺损区点种注入经过培养2周后的自体骨髓间充质细胞悬液（约1×107 mL-1），单纯骨膜移植组，也用同样的方法行自体胫骨膜移植，但移植后不注入骨髓间充质细胞，对照组兔缺损区，不作任何处理。完毕，复回髌骨，逐层关闭伤口，下肢不固定，笼中自由喂养。 　　组织学观察与评估：分别于术后2、4、12、24周处死动物，取出标本，对修复组织进行大体观察后，立即将标本浸入10%甲醛中固定，然后将标本浸入0.3 mol/L EDTA中脱钙3周，再用石蜡包埋标本，对修复组织进行切片，作常规HE染色和甲苯胺蓝染色以观察软骨基质分泌情况。2个移植组兔各送1份标本行透射电镜观察。 　　对修复组织的组织学和组织化学的质量评分，采用Pineda等描述的标准[1]，包括6项内容：细胞形态（1～5分）、基质染色（1～4分）、表面光滑度（1～4分）、与邻近软骨对合情况（1～3分）、有无退变发生（1～2分）、潮标是否形成（1～2分），共6～20分。评分后数据作方差分析，P0.05为有显著性意义。 　　2 结果 　　大体观察：骨髓间充质细胞加骨膜移植组24周见修复组织大部分已接近毗邻正常软骨形态，稍高出毗邻软骨， 表面变得光滑、平坦， 与毗邻软骨界限已不十分清楚。无论色泽及质地均与周围透明软骨相近；单纯骨膜移植组24周后见修复组织也填充缺损，但形态上更像纤维软骨，色泽与相邻软骨有明显差别，同时接合部分界明显，表面仍稍低于周围正常组织，而对照组兔24周时见缺损区内仅有一薄层的肉芽组织填充，表面明显低于周围软骨且不规则，质地柔软，压之有明显的凹陷感。 　　光镜观察：骨髓间充质细胞加骨膜移植组兔4周时修复组织已呈透明软骨样特点，细胞数明显增多，基质染色深于正常软骨组织，12周时，细胞逐渐分层排列，基底层有血管长入，形成软骨下骨，潮标已开始形成，24周的修复组织已完全呈透明软骨特点。单纯骨膜移植组兔术后2～4周时，仅见一些散在的软骨细胞，很少成簇出现，基质染色较淡，到24周仍有大量纤维填充，呈现纤维软骨样修复。对照组兔术后24周见缺损区内有薄层的肉芽样结构，4～12周时修复组织主要为纤维组织，内含丰富的纤维和少量的细胞，24周时发现有4例为纤维组织修复，基质染色为阴性，仅有1例获得纤维软骨修复。 　　标本切片的组织学和组织化学评分结果见表1。表1结果表明，骨髓间充质细胞加骨膜移植组各期得分均明显优于另外二组（P0.01），而单纯骨膜移植组各期得分也高于对照组，2组间也有显著性差异（P0.05）。 　　电镜观察：骨髓间充质细胞加骨膜移植组24周兔送去1份标