银杏叶乳膏研制及皮肤抗衰老的作用初步的研究.docVIP

银杏叶乳膏研制及皮肤抗衰老的作用初步的研究 　　摘 要：目的：研制银杏叶乳膏及其对小鼠皮肤抗衰老的作用。方法：①用纳米级银杏叶提取物粉末制备银杏叶乳膏。②采用实验兔正常皮肤组和破损皮肤组给药，进行皮肤刺激性强度评价和组织病理检查。③注射D-半乳糖建立小鼠衰老模型，将小鼠背部涂抹银杏叶乳膏、维生素E乳膏、空白基质乳膏，测定小鼠背部皮肤组织匀浆中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、羟脯氨酸（HYP）含量，并取皮肤组织作组织病理学检查。④对小鼠皮肤组织提取RNA，采用定量PCR方法，检测SOD基因的转录。 结果：①制备银杏叶乳膏，质量符合要求；加速/长期条件下稳定。②在实验兔皮肤刺激性试验中，皮肤无红斑、水肿等刺激性反应；③在皮肤抗衰老试验中，与模型对照组比较，银杏叶乳膏各组MDA含量降低，SOD基因表达水平显著提高，SOD活力升高，HYP含量升高，中、高剂量组各指标变化均显著（P0.05，P0.01）；同时，组织病理学结果显示中、高剂量组小鼠皮肤结构清晰完整，真皮层增厚，基底细胞增多，胶原纤维数目增多，毛囊数目增多。 　　关键词：银杏叶提取物 乳膏 超氧化物歧化酶（SOD） 羟脯氨酸（HYP） 丙二醛（MDA） 抗衰老 　　1乳膏抗衰老实验 　　1.1动物实验 　　1.1.1衰老模型的建立[2-8] 　　取3月龄KM小鼠70只，小鼠颈背部皮下注射1000mg/kg D-半乳糖，1次/天，连续注射42天。另取10只小鼠作为正常对照组，皮下注射等体积0.9%氯化钠注射液。所有小鼠背部脱毛，暴露约2cm×2cm大小皮肤。 　　1.1.2 分组及给药 　　将上述衰老模型小鼠随机分成6组，每组10只。空白对照组涂抹0.5g不含银杏叶提取物的空白基质，低、中、高剂量组分别涂抹含银杏叶提取物1%、2%、4%浓度的乳膏0.5g，维生素E组涂抹0.5g维生素E乳膏。每日早晚各一次，开始造模当日起连续涂抹42天，涂抹前先用温水洗净皮肤，并及时剃去新长出的鼠毛。口服给药组灌胃给予100mg/kg的银杏叶提取物，每日早晚各一次，开始造模当日起连续给药42天。 　　1.1.3实验标本与取材方法 　　42天后，所有小鼠颈椎脱臼处死，去毛，取背部正中皮肤0.5cm×0.5cm大小，迅速放入10%中性福尔马林液中固定，作组织病理学检查。取余下背部皮肤用于制备10%皮肤匀浆液。 　　1.1.4 10%皮肤匀浆液的制备 　　剪取背部皮肤组织0.5g，用预冷生理盐水漂洗，除去皮下脂肪和其他结缔组织，滤纸拭干，称重，剪碎组织块后倒入匀浆管中，加入该组织块9倍质量的生理盐水，用组织分散机制成质量分数为10%的组织匀浆。取少量组织匀浆涂片，在显微镜下观察细胞破碎情况，若破碎不完全，则反复冻溶3次，使其完全破碎，细胞内容物完全游离在液相中。 　　1.2 SOD、MDA及HYP的检测 　　1.2.1组织切片染色方法 　　取已固定皮肤组织，石蜡包埋、切片、脱蜡、脱水、HE 染色，光学显微镜（×200）下观察。 　　1.2.2皮肤生化指标的测定 　　皮肤组织匀浆SOD活力、MDA含量的分别参照南京建成生物工程公司SOD及MDA试剂盒说明书方法测定。 　　1.2.3皮肤组织HYP含量的测定 　　参照南京建成生物工程公司HYP试剂盒说明书方法测定皮肤组织匀浆中HYP含量。 　　1.2.4 统计学处理 　　所有实验结果以x±s表示，采用组间t检验统计学方法分析。 　　1.3 皮肤 SOD基因表达检测方法[9-10] 　　1.3.1 皮肤组织总RNA的提取： 总RNA的提取采用改进的异硫氰酸胍酚―氯仿RNA快速提取法[11-12] 。 　　1.3.2反转录： 　　1.3.3实时定量 PCR分析： 　　2结果与讨论 　　2.1 抗衰老实验检测 　　2.1.1动物外观及行为学观察 　　连续造模42天后，模型对照组小鼠出现脊椎隆起，体形消瘦，毛色灰暗稀疏、无光泽，行动迟缓，与正常组相比，出现明显的老年体征，证明衰老模型成功建立。银杏叶乳膏中、高剂量组及维生素E组的衰老模型小鼠皮毛浓密光亮、顺滑、行动敏捷；空白基质组及低剂量组小鼠则无明显改善。 　　2.1.2 皮肤组织病理学形态观察 　　正常对照组（图3-1），皮肤组织结构正常，基底细胞排列整齐，真皮层厚度正常，细胞层数均匀，胶原纤维丰富，排列致密，毛囊数目正常，排列均匀。模型对照组（图3-2）、空白对照组（图3-3）皮肤结构紊乱，真皮厚度变薄，皮下组织稀疏，基底细胞层数减少，体积减小，胶原纤维排列疏松，厚度变薄，毛囊数目减少。维生素E组（图3-7）、口服给药组（图3-8），皮肤结构较清晰，真皮层较模型对照组增厚，基底细胞增多，胶原纤维数目较，排列较致密，毛囊数目较模型对照组