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金雀异黄素衍生物dFMGEN体内外抑制人乳腺癌MCF―7细胞增殖的作用的研究
金雀异黄素衍生物dFMGEN体内外抑制人乳腺癌MCF―7细胞增殖的作用的研究
【摘要】 目的:观察金雀异黄素(genistein,GEN)衍生物7-二氟亚甲基-5,4’-二-正辛烷氧基异黄酮(dFMGEN)对 MCF-7细胞体内外增殖的影响。方法:dFMGEN处理MCF-7细胞后,采用MTT法检测dFMGEN对乳腺癌MCF-7细胞的体外细胞增殖的影响;PI染色流式细胞术分析dFMGEN对细胞周期和凋亡的影响;建立MCF-7裸鼠异种移植瘤模型检测dFMGEN体内抑制乳腺癌增殖的作用。结果:dFMGEN可显著抑制人乳腺癌MCF-7细胞的体内外增殖,使MCF-7细胞阻滞于G1期。结论:金雀异黄素衍生物dFMGEN具有抑制乳腺癌细胞的增殖作用,其机制可能与其诱导细胞G1期阻滞相关。
【关键词】 乳腺癌; 金雀异黄素; 衍生物; 细胞周期
中图分类号 R737.9 文献标识码 B 文章编号 1674-6805(2013)36-0147-02
金雀异黄素(genistein,GEN)是在大豆中天然存在的异黄酮类物质。研究表明,GEN是一种强力的酪氨酸蛋白激酶和拓扑异构酶抑制剂,能通过多种途径在体外显著抑制多种细胞的生长[1]。但由于其在体内很难达到有效的血药浓度,因而限制其体内的抗肿瘤作用的发挥[2]。为增加GEN体内的生物学活性,研究者们试图对金雀异黄素进行结构改造[3],以期提高其体内抗肿瘤作用。本实验旨在前期对GEN进行结构改造研究基础上进一步研究GEN衍生物dFMGEN体内外抗乳腺癌MCF-7细胞增殖的作用。
1 材料与方法
1.1 药物和试剂
金雀异黄素衍生物dFMGEN合成方法详见参考文献[4]。金雀异黄素、二甲基亚砜(DMSO)、MTT为Sigma公司产品;PRMI-1640培养基等细胞培养用试剂为Gibco公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞与细胞培养 人乳腺癌细胞MCF-7购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。细胞培养于含10%小牛血清(FCS),1×105 U/L链霉素及1×105 U/L青霉素的RPMI-1640培养基中常规培养传代,取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2 MTT实验检测dFMGEN对细胞增殖的影响 按1.5×104/孔的密度接MCF-7细胞种于96孔板,待细胞贴壁后加入20 μl不同浓度dFMGEN,使其终浓度分别为5、10、20、40 μM,GEN对照组为40 μM的GEN,GEN对照组加入相同体积含终浓度为0.1% DMSO的完全培养基,每组设6个复孔,分别处理24 h或48 h。在培养结束前4 h每孔加入5 g/L MTT 20 μl,显示后用酶标仪(EX-800型)在570 nm波长测吸光值(A值)。
1.2.3 流式细胞术检测细胞周期及凋亡 收集经不同药物处理的dFMGEN细胞,冷PBS洗2遍,用4 ℃的70%乙醇固定24 h后,经碘化丙啶(PI)染色,用流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡情况。
1.2.4 裸鼠异种移植瘤治疗实验 取雌性Balb/c-nu小鼠20只,4周龄,体重约9~11 g,调整MCF-7细胞浓度为3×107/ml,按
0.2 ml/只接种于小鼠背部皮下,出现移植瘤后按公式V=W2(短径)×L(长径)×0.52计算瘤体积,待移植瘤体积达100 mm3左右时随机分为5组,即对照组(含0.1% DMSO的PBS);GEN对照组(GEN 45 mg/kg);低、中、高剂量dFMGEN组(dFMGEN 5、15、45 mg/kg)。各组均隔日经腹腔注射给药1次,共计10次,末次给药48 h后脱臼处死小鼠,称取瘤及肝脾重量。
1.3 统计学处理
采用SPSS 12.0统计软件分析数据,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,进行One-way ANOVA检验及t检验,P0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 dFMGEN对体外培养的MCF-7细胞增殖的影响
采用MTT法检测不同浓度dFMGEN或GEN对MCF-7细胞生长的影响,dFMGEN能呈时间-剂量依赖性抑制体外培养的人乳腺癌MCF-7细胞增殖,且作用强于母体化合物GEN的GEN对照组(P0.05),详见表1。
2.2 dFMGEN和Genistein对MCF-7细胞周期及凋亡的影响
流式细胞术检测结果提示,10、40 μM的dFMGEN作用于MCF-7细胞48 h后,其G1期细胞分别为65.6%和81.6%,较空白对照组和40 μM Gen处理组的51.5%和63.4%有明显提高(P0.05),呈现出明显的G1期阻滞现象,但其对细胞的凋亡的影响不明显。
2.3 dFMGEN对人乳腺癌
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