雌激素通过MAPK信号通路刺激内皮祖细胞的增值和迁移-内科学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 10 雌激素通过 MAPK 信号通路刺激内皮祖细胞的 增值和迁移 摘 要 目的：观察丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）及其亚族细胞外信号调节 激酶（extracellular-signal regulated protein kinase ERK）、c-Jun 氨基末 端激酶（JNK）/应激激活蛋白激酶（SAPK）、p38 在雌激素刺激内 皮祖细胞（EPCs）迁移和增值中的作用。方法：（1）单个核细胞的 分离：用 50U/ml 肝素 2ml 润湿空针后抽取脐带血约 50ml，加入 3% 明胶 16ml（脐带血:明胶=3:1）沉淀后加入人淋巴细胞分离液用密度 梯度离心法分离出单个核细胞，活力计算活性达 98%可以接种。（2） 诱导分化：成纤维细胞多于 24 小时内贴壁，因此培养 24 小时后取未 贴壁细胞以 4×106 /cm2 接种于包被有纤维连接蛋白的 24 孔培养板(每 孔 lml)，每孔中加入 M199 培养液 lml，添加 10%胎牛血清、1%青链 霉素(1 万单位/ml)、 VEGF（50ng/ml），置于 5%CO2、饱和湿度 37℃ 孵育箱中培养，换培养液培养至 7d，贴壁细胞供实验用。（3）EPCs 鉴定：培养细胞爬片后，然后分别加入鼠抗人 CD133 单克隆抗体 (1:100 稀释)、DiI-ac-LD、FITC-UEA-1 分别在倒置相差显微镜及免 疫荧光显微镜下观察拍照。（4）实验分组：本实验共分五组，分别为 对照组：正常培养 EPCs 未加入任何药物；雌二醇（E2）组：EPCs 培 养 7 天后加入 E2 ；PD98,059(ERK 抑制剂)组：培养 7 天后先用 PD98,059 作用细胞 24h 再加入 E2 ；SP600125（JNK 抑制剂）组：培 养 7 天后先用 SP600125 作用细胞 24h 再加入 E2 ；SB203580（p38 抑制剂）组：培养 7 天后先用 SB203580 作用细胞 24h 再加入 E2。（5） 观测指标：①酶联免疫检测仪检测各组活细胞数（结果以吸光值表 示）。②选取特定浓度用流式细胞检测仪分析各组细胞周期变化。③ 将细胞悬液种在 Traswell 小室上层，下层加入趋化因素，观察由上层 小室迁入下层小室的细胞数。结果：（1）单个核细胞分离：从脐带血 中分离的单个核细胞在显微镜下呈圆形、透亮，台盼蓝染色显示存活 率95%。（2）EPCs 鉴定：取培养第 7 天的细胞做免疫荧光检测 CD133 呈绿色，阳性率达 95%以上。取培养第 9 天的细胞检测内皮细胞特异 性抗体 Dil-ac-LDL 呈红色，FITC-UAE-1 呈绿色，Dil-ac-LDL 和 FITC-UAE-1 双染的细胞为 EPCs 呈现黄色。染色结果显示黄色细 胞90%。（3）酶联免疫检测活细胞数实验结果：对照组的吸光值为 0.4163±0.0503，E2 组吸光值为 0.6940±0.0143，与对照组相比有 显著意义（P0.05），说明 E2 可以引起 EPCs 增值；PD98,059 在 5umol/L、 10umol/L、20umol/L、40umol/L、80umol/L 吸光值分别为 0.7406± 0.0376、0.6177±0.1043、0.5211±0.0793、0.5032±0.0975、0.4522 ±0.0406，与 E2 组比较 PD98,059 在 20umol/L、40umol/L、80umol/L 时有统计学意义（P0.05），表明 PD98,059 可以阻断 E2 引起的 EPCs 增值；SP600125 在 1umol/L、25umol/L、50umol/L、75umol/L、100umol/L 吸光值分别为 0.6152±0.0406 、 0.4255±0.0395 、 0.3882±0.0185 、 0.4090±0.0761、0.4168±0.1012，与 E2 组相比 SP600125 在 25umol/L、 50umol/L、75umol/L、100umol/L 时有统计学意义（P0.05），表明 SP600125 可以阻断 E2 引起的 EPCs 增值； SB203580 在 5umol/L、 10umol/L 、 15umol/L 、 20umol/L 、 25umol/L 吸 光 值 分 别 为 0.6670±0.6223 、 0.6350±0.8311 、 0.6312±0.6437 、 0.6285±0.6462 、 0.6500±0.6036，与 E2 组相比所有浓度均没有统计学意义（P0.05）。 （4）流式细胞仪检测细胞周期：E2 组 S 期所占比例为（33.15±0.212）% 与对照组（11.55±0.