非小细胞肺癌对吉非替尼治疗反应的影响因素及联合应用CIK细胞的临床意义-呼吸内科学专业论文.docx

广州医学院博士学位论文非小细胞肺癌对吉非替尼治疗反应的影响因素及联合应用 广州医学院博士学位论文 非小细胞肺癌对吉非替尼治疗反应的影响因素及联合应用 CIK 细胞的临床意义 PAGE PAGE 3 第二部分 吉非替尼耐药人肺腺癌 PC-9 细胞株的建立及其生物学特性 选择吉非替尼敏感的人肺腺癌 PC-9 细胞株（EGFR 基因外显子 19 E746- A750 缺失，p53 突变），采纳大剂量吉非替尼冲击结合逐步递增浓度体外诱导 获得吉非替尼耐药株 PC-9/GR。用 CCK-8 法检测细胞的耐药指数，测定细胞群 体倍增时间和细胞生长曲线，软琼脂克隆形成试验观察细胞的体外克隆形成能 力，PI 染色法和 Annexin-v/7-AAD 双标记法观察细胞周期和细胞凋亡，探讨吉 非替尼对 PC-9 细胞和 PC-9/GR 细胞的治疗反应，PCR 直接测序法分析 PC-9 细 胞和 PC-9/GR 细胞 EGFR 基因外显子 19、20 序列，Western blot 法检测 PC-9 细胞和 PC-9/GR 细胞 EGFR 信号转导通路分子的表达，免疫细胞化学染色法检 测 PC-9 和 PC-9/GR 细胞 p53 蛋白表达。 第三部分 CIK 细胞对吉非替尼耐药肺腺癌（PC-9/GR）细胞的杀伤效应研究 应用细胞与裸鼠移植瘤实验，比较观察 CIK 细胞对 PC-9 和 PC-9/GR 细胞 的杀伤率以及对移植瘤增殖的抑制效率，研究 CIK 细胞与吉非替尼联合应用对 耐药株 PC-9/GR 的协同杀伤效应。 第四部分 CIK 细胞输注对肿瘤患者免疫微环境的调节 为了进一步理解CIK细胞过继回输可能的免疫调节机制在应对耐药中的地 位，对4例恶性肿瘤患者共6个疗程回输CIK细胞治疗后的免疫内环境进行了动态 观察。CIK细胞过继回输采纳新建的CO2循环供气密闭波浪式CIK细胞培养系统， 流式细胞仪跟踪CIK细胞的诱导分化，CCK-8法检测CIK细胞体外杀伤K-562肿瘤 细胞活力，分别于患者接受CIK细胞输注前、输注后1天、1周、2周、1月采集EDTA 抗凝外周血，应用流式细胞仪和液相芯片检测分析免疫细胞亚群和细胞因子/趋 化因子的动态变化。与此同时，对新建体系与静置培养系统体外扩增培养CIK细 胞的效率进行了研究比较，并观察了重组人IL-2撤除及冻存、复苏对CIK细胞杀 伤活性的影响，为建立高效、节能、具有质量保障的CIK细胞临床应用标准化规 范流程提供可参照模板。 结 果 第一部分 吉非替尼对 NSCLC 的疗效及其影响因素 33 例接受吉非替尼治疗的患者，总体客观缓解率为 42.4%，中位疾病无进 展生存期为 3.000（1.972～4.028）个月，单因素分析显示血浆 EGFR 基因突变 阳性的患者或不吸烟患者接受吉非替尼治疗的客观有效率和中位疾病无进展生 存期高于血浆 EGFR 基因突变阴性的患者或吸烟患者，P0.05；多因素回归分 析显示血浆游离核酸 EGFR 基因突变为吉非替尼治疗客观缓解率的唯一独立影 响因素（P=0.002），而血浆游离核酸 EGFR 基因突变（P=0.007）、吸烟史（P=0.040） 均为疾病无进展生存期的独立影响因素。分层分析显示：吸烟史主要影响 EGFR 基因突变患者吉非替尼治疗的中位疾病无进展生存期，P0.05。 在总共 77 例标本中，检出 EGFR 基因突变 35 例（45.5%），其中不吸烟患 者肿瘤组织样本中 EGFR 基因突变明显高于吸烟患者（56.1% vs. 33.3%， P=0.045），但性别对 EGFR 基因突变率没有明显影响；在 50 例肺癌组织中， p53 突变蛋白检出率为 48.0% (24/50)，EGFR 表达阳性率为 48.0% (24/50)，p-Akt 蛋白阳性率为 48.0% (24/50)，p-Erk 蛋白阳性率为 36.0% (18/50)，p-Stat3 蛋白 阳性率为 24.0% (12/50)。p53 突变蛋白在吸烟患者(61.5%，16/26)和 EGFR 基因 野生型患者(60.7%，17/28)中的表达显著高于不吸烟患者(33.3%，8/24)和 EGFR 基因突变患者(31.8%，7/22), P0.05，而 p-Akt、p-Erk、p-Stat3 蛋白的表达与吸 烟史、EGFR 基因突变未见明显相关性；进一步分析吸烟对不同 EGFR 基因突 变状态 NSCLC 患者 EGFR、p-Stat3、p-Erk、p-Akt、p53 蛋白表达影响时发现， 在 EGFR 基因野生型肺癌中，吸烟与否与 p53 突变蛋白的表达并无相关性；而 在 EGFR 基因突变型肺癌，吸烟患者 p53 突变蛋白检出率则明显高于不吸烟者， 75.0% vs.