泛素连接酶Hrd1介导神经细胞内过度磷酸化tau蛋白降解-神经生物学专业论文.docx

3.1.6 DH5α 感受态细胞的制备 21 3.1.7 质粒转化 22 3.1.8 质粒的小量提取 22 3.1.9 重组质粒的鉴定 23 3.1.10 质粒的中量提取 24 3.2 细胞培养及转染 24 3.2.1 肿瘤细胞 24 3.2.2 原代胎鼠皮层神经元 25 免疫印迹（Immunoblotting，IB） 25 3.3.1 蛋白样品制备 25 3.3.2 SDS凝胶制备 25 3.3.3 上样电泳 26 3.3.4 转膜 26 3.3.5 IB 检测 26 RT-PCR 26 RNA 提取 20 RT 反应 27 PCR 扩增 27 3.5 免疫共沉淀 28 3.6 蛋白质互补实验 28 3.7 CHX 示踪实验 29 3.8 细胞免疫荧光染色 29 3.9 细胞活力测定(MTT) 30 3.10 统计学处理 30 4 结果30 4.1 Hrd1 与 tau 蛋白之间的相互作用 30 4.1.1 免疫共沉淀 31 4.1.2 蛋白质片段互补实验 31 4.2 Hrd1 降低过度表达的 tau 蛋白的水平 33 4.3 Hrd1 降低过度磷酸化 tau 的水平 34 4.4 Hrd1 促进过表达的外源性 tau 蛋白的降解 34 4.5 Hrd1 促进内源性过度磷酸化 tau 蛋白降解 35 4.6 Hrd1-siRNA 的设计和验证 37 4.7 Hrd1-siRNA 抑制内源性过度磷酸化 tau 蛋白的降解 38 4.8 Hrd1-siRNA 对细胞活力的影响 39 4.9 原代皮层神经元培养及鉴定 40 4.10 Hrd1-shRNA 对原代培养的胎鼠皮层神经元的影响 41 5 讨论42 6 结论46 7 本研究的创新点 47 8 参考文献47 附录51 致 谢53 综 述54 PAGE PAGE 1 英文缩略词表（Abbreviation） 英文缩写 英文全称 中文全称 AD AP APP Aβ Alzheimer’s disease Ammonium persulfate Amyloid precursor protein β-amyloid 阿尔茨海默病 过硫酸铵 淀粉样前体蛋白 β-淀粉样蛋白 BSA Bovine serum albumin 牛血清白蛋白 CHX DAPI Cycloheximide 46-diamidino-2-phenylindole 放线菌酮 4,6-二脒基-2-苯基吲哚 DMEM Dulbeccos modified Eagles medium 培养液 DMSO Dimethylsulfoxide 二甲基亚砜 ER endoplasmic reticulum 内质网 ERAD ER-associated degradation 内质网相关的降解 FCS Fetal bovine serum 胎牛血清 GSK Glycogen synthase kinase 糖原合成酶激酶 GFAP Glial fibrillary acidic protein 神经胶质纤维酸性蛋白 GFP Green fluorescence protein 绿色荧光蛋白 HRP Horse radish peroxidase 辣根过氧化物酶 IP Immunoprecipitation 免疫共沉淀 NeuN Neural nuclei protein 神经核蛋白 NFTs Neurofibrillary tangles 神经原纤维缠结 OA Okadiac acid 冈田酸 OD Optical density 光密度值 PCA Protein compelementation assay 蛋白质互补实验 PBS Phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液 PKA Protein kinase A 蛋白激酶 A PKC Protein kinase C 蛋白激酶 C rpm Rotates per minute 每分钟转速 SDS  Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺 凝胶电泳 TEMED N,N,N’,N’-tetramethylenediamine 四甲基乙二胺 UPP Ubiquitin proteasome pathway 泛素蛋白酶体通路 UPR unfolded protein response 非折叠蛋白质反应 WB Westernblotting 免疫印迹 泛素连接酶 Hrd1 介导神经细胞内 过度磷酸化 tau 蛋白降解 研究生： 孙爱民 导 师： 沈玉先 教授 教育部