三角帆蚌凝集素细胞凝集性研究.docVIP

三角帆蚌凝集素的细胞凝集性研究 　　摘要：将三角帆蚌的肌肉凝集素粗提液与动物（草鱼、兔、老鼠、家鸡）及人的A 、B、O、AB型共8种血红细胞悬液和五种微生物进行凝集反应以检测其凝集活性，同时进行糖抑制试验。结果表明：三角帆蚌肌肉凝集素能凝集实验用的8种红细胞，其中对兔红细胞凝集活力最强；不能和供试的五种微生物发生凝集反应；不同的糖对凝集活性影响不同。 　　关键词：三角帆蚌；凝集素；肌肉提取液；凝集活性 　　 　　凝集素的凝集和调理作用是软体动物非特异性体液免疫的重要内容[1], 在无脊椎动物的防御系统中有重要作用[2]。三角帆蚌(Hyriopsis cumingii) 隶属软体动物门、瓣鳃纲、蚌科、帆蚌属，为我国特有种[3]，是我国淡水育珠普遍应用的一种蚌。薛江楠等[4]在两种淡水育珠蚌(三角帆蚌和背角无齿蚌) 血清中发现有凝集素存在，并对其分子结构、物理性质进行了研究。但三角帆蚌凝集素的凝集性能未见报导。本文采用盐析方法获得具有一定蛋白浓度的肌肉凝集素提取液，选用不同动物红细胞和人4种血型红细胞对三角帆蚌凝集素进行检测，并进一步选用微生物细胞进行凝集素的活性测定，同时进行糖抑制试验，以期为研究凝集素的凝集性能、开发凝集素资源提供理论依据和基础资料。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1材料 　　实验用三角帆蚌及供血动物均购于南昌市江大南路菜市场；凝集测定用人全血由江西省血液中心提供，用3.8%柠檬酸钠抗凝，4℃冷藏保存备用；枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等微生物由南昌大学生命科学学院提供，其余试剂为国产分析纯。 　　1.2研究方法 　　1.2.1凝集素的制备 　　取三角帆蚌的肌肉，按1:2(v/v)加入0.85%生理盐水，捣碎机匀浆5min后5000r/min低温离心20min,取上清液加入硫酸铵至80%饱和度，4℃过夜。第2天取出4℃下5000r/min离心30min后收集沉淀。沉淀用PBS（pH7.4）溶解，4000r/min离心10min,取上清夜在PBS中透析过夜，第2天在蒸馏水中再透析2-4h,聚乙二醇浓缩，得到凝集素粗提液。由以下公式[5]计算粗提液中的蛋白质含量。 　　蛋白质含量（mg/ml）= 1.45A280nm - 0.74A260nm 　　式中A280nm是蛋白质溶液在280nm下测定的光吸收值 　　A260nm是蛋白质溶液在260 nm下测定的光吸收值 　　1.2.2 2%红细胞样品的制备 　　取3.8%柠檬酸钠抗凝的人A、B、AB、O型血及家鸡、草鱼、兔、老鼠血全血血样，用0.85%的生理盐水反复洗涤3次，每次以3000rpm/min 离心5min，按血细胞压积比配成2%的红细胞悬液，4℃冷藏备用。 　　1.2.3菌悬液的制备 　　大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）三种细胞用牛肉膏蛋白胨培养基活化3代后；酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)和黑曲霉(Aspergillus niger)用查氏培养基活化3代后， 收集配成浓度为109个/ml的菌悬液保存备用 　　1.2.4血凝活力测定 　　活力测定在96孔V型血凝板上进行。首先，在每孔加入30μl磷酸盐缓冲液（PBS），然后于第一孔中加入30μl凝集素粗提液，混匀后，再从第一孔中吸取上述混合液30μl加入第二孔，照此作倍比稀释，最后在每孔中加入30μl的体积分数为2%的红细胞悬液，柔和振匀。室温下放置1h后观察。无凝集现象时红细胞在Ｖ型孔底部呈沉降性红点状，有凝集现象时呈网状不下沉，而后用显微镜进行检测。血凝活力以产生凝集现象的凝集素最大稀释倍数(2ｎ)表示，PBS作空白对照。 　　1.2.5细菌菌体凝集测定 　　在96孔V型血凝板加30μl凝集素粗提液与等量磷酸盐缓冲液（PBS）倍比稀释后，加入等体积的菌悬液，振荡摇匀。室温下放置1h后用显微镜（高倍镜）进行检测。凝集活力以产生凝集现象的凝集最大稀释倍数(2n)表示，以PBS作空白对照。 　　1.2.6糖抑制试验 　　试验用的5种糖分别为乳糖、D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，其浓度均为2.5mg/ml。血凝板每孔中加入凝集素提取液、糖溶液各30μl，放置10min后再分别加入30μl8种2%血细胞悬液，检测凝集情况。 　　 　　2结果 　　 　　2.1凝集素的凝集活力测定 　　用紫外吸收法测三角帆蚌肌肉凝集素提取液中蛋白质的浓度为0.84 mg/ml。三角帆蚌肌肉凝集素提取液的血凝集活力显示（见表1）：三角帆蚌的肌肉凝集素提取液能凝集人的A、B、O、AB型、兔、家鸡、草鱼、老鼠