泛素-蛋白酶体途径对拟除虫菊酯神经毒性的影响及机制初探-劳动卫生与环境卫生学专业论文.docx

泛素- 蛋白酶体途径对拟除虫菊酯神经毒性的 影响及机制初探 博士研究生 黄晓薇 指导教师 石 年 教授（博士） 摘 要 拟除虫菊酯（pyrethroids，Py）是继有机氯、有机磷和氨基甲酸酯之后迅 速发展起来的新型农药，根据化学结构可分为不含氰基的Ⅰ型如联苯菊酯（bif enthrin,BF）和含有氰基的Ⅱ型如溴氰菊酯（deltamethrin,DM）。它们具有选择 性毒性、哺乳动物体内代谢和排泄迅速、环境残留较少等特点。自上世纪 70 年 代以来，拟除虫菊酯已经被广泛应用，而作为一种神经毒物，其神经毒性日益引 起普遍关注。本室对 DM 的神经毒性的研究已有近 20 年的历史，发现 DM 染毒可 使大鼠脑组织氧化损伤，神经细胞 Ca2+内流增加，线粒体膜电位下降，细胞色素 C 释放增加以及 caspase-3 活力改变,对 DM 神经毒性的了解已有长足的进步，但 目前确切的神经毒作用机制仍未十分明了。 自上世纪初始人们关注的热点主要集中在蛋白质的化学结构和生物学功能， 以及蛋白质的合成。而对于蛋白质的降解过程关注较少。2004 年诺贝尔化学奖 授予科学家以表彰他们在蛋白质降解调节机制的重大发现，这个蛋白质降解机制 即泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome pathway,UPP）。它是近年来受到 重视的调节蛋白质降解与功能的重要系统，其主要功能在于降解细胞内半衰期较 短的调节蛋白和结构异常、错构或受损伤的蛋白。UPP 参与许多细胞生命过程， 包括细胞周期调控、信号转导、DNA 损伤修复、抗原提呈以及细胞凋亡等，并与 神经系统许多疾病的发生发展密切相关，如帕金森病（Parkinson’s disease, PD）、阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）等，因此对该途经的研究已成 为目前医学研究的热点之一，而对该途径参与毒作用机制的报道并不多见。 本研究以大鼠为研究对象，在以往 DM 神经毒性的作用机制研究的基础上， 探索蛋白质的降解是否参与 Py 的神经毒作用机制中，为深入了解神经毒性提供 新的思路。从整体方面，给予 DM 和蛋白酶体抑制剂 MG-132，利用现代生物化学 和分子生物学方法和技术，观察泛素-蛋白酶体途径在 DM 致大鼠海马细胞凋亡的 中的作用，进一步的探讨 DM 致大鼠神经毒性的新途径。由于泛素-蛋白酶体途径 是非特异性的，以 BF 为Ⅰ型拟除虫菊酯类代表，验证泛素-蛋白酶体途径致大鼠 的神经损伤中的作用，不仅观察细胞凋亡，而且增加了有关细胞氧化应激。在体 外条件下，以 SH-SY5Y 细胞为模型，探讨泛素-蛋白酶体途径在 DM 和 BF 所致细 胞毒性中的作用，试图为拟除虫菊酯类农药中毒的预防和治疗提供科学依据。 第一部分 UPP 在 DM 致大鼠神经毒性的作用及机制初探 第一节 DM 对大鼠海马细胞泛素化蛋白表达的影响 目的：观察 DM 对大鼠海马细胞泛素化蛋白表达的影响。 方法：采用 DM 12.5mg/kg 体重（溶剂色拉油）对雄性 Wistar 大鼠一次腹 腔注射，分别于 5h、24h、48h 后处死，免疫组织化学法观察大鼠海马 CA1、CA2、 CA3、CA4 区泛素化蛋白的表达；免疫蛋白印迹法（western blot）检测海马细 胞泛素化蛋白的表达。 结果：经 DM 染毒后，不同时间点的泛素化蛋白表达用免疫组织化学方法测 定。其结果：在海马 CA1 区，各 DM 处理组泛素化蛋白表达为 5h（0.30±0.04）、 24h（0.27±0.03）、48h（0.23±0.02），与对照组（0.18±0.02）相比，差异有 统计学意义（P0.05）。海马 CA2 区，各 DM 处理组泛素化蛋白表达为 5h （0.29±0.04）、 24h（0.26±0.03）、48h（0.22±0.02），与对照组（0.19±0.02） 相比，差异有统计学意义（P0.05）。 海马 CA3 区，各 DM 处理组泛素化蛋白表 达为 5h（0.25±0.04）、 24h（0.21±0.03）、48h（0.19±0.02），与对照组 （0.15±0.01）相比，差异有统计学意义（P0.05）。海马 CA4 区，各 DM 处理组 泛素化蛋白表达为 5h（0.28±0.03）、 24h（0.23±0.02）、48h（0.19±0.03） 组,与对照组（0.17±0.01）相比，差异均有统计学意义（P0.05）。Western blot 发现，DM 染毒 5h、24h、48h 组的泛素化蛋白分别为（9.55±1.74）、（8.06±1.55）、 （8.53±0.92），与对照组