肺炎支原体ORF6区基因的克隆与表达及应用于血清学诊断的初步分析-流行病与卫生统计学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 1 肺炎支原体 ORF6 区基因的克隆与表达及应用于血清学 诊断的初步研究 摘 要 肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae ，MP）是引起气管支气管炎和原发性 非典型性肺炎的主要病原体，10％－30％的社区获得性肺炎是由 MP 引起的。鉴 于 MP 的生长缓慢且从临床样本中进行分离培养相当困难不适用于该病原体感染 的诊断,此外由于 MP 缺乏细胞壁,用于治疗细菌感染的青霉素和β内酰胺类药物 对它无效。为了能够尽早地使用恰当的抗菌素进行治疗，用可靠而敏感的血清学 检测方法对 MP 早期感染的临床诊断进行证实是必须的。研究表明，MP P90 粘附 相关蛋白具有很强的免疫原性，是 MP 诊断和疫苗研究的重要候选抗原分子。 本研究采用 PCR 方法，从肺炎支原体 FH 株基因组中扩增了长为 1003bp 的 ORF6 区 DNA 片段，用 TA 克隆的方法克隆该片断，并以该重组质粒为模板，扩增 ORF6 区基因，此扩增产物经过双酶切后克隆到表达载体 pET -32a(＋)中，转化 大肠杆菌 BL21(DE3)，经 IPTG 诱导表达后得重组蛋白 pro2174-3176。采用 SDS和 Western blot 验证，在相对分子量 56.8kDa 处有阳性表达条带,符 合预期大小；该蛋白带能与肺炎支原体阳性血清反应，具有良好的免疫原性，可 以作为抗原检测肺炎支原体抗体。用电洗脱法纯化重组蛋白可获得高纯度的重组 蛋白，以纯化的重组蛋白作为包被抗原，采用方阵滴定法确定抗原最佳工作浓度， 按照确定的抗原最佳工作浓度包被酶标板，建立间接 ELISA 法检测肺炎支原体 IgM 抗体，并与国外 2 种商品化 ELISA 试剂盒检测结果对照，初步考核检测方法 的敏感性和特异性。结果表明本研究建立的间接 ELISA 方法特性强、敏感度高， 为试剂盒的研制与开发奠定了基础。 关键词：肺炎支原体 ORF6 区 克隆 蛋白表达 蛋白纯化 间接 ELISA 法 Cloning and expression of ORF6 gene from Mycoplasma pneumoniae and its preliminary application in serological diagnosis Abstract Mycoplasma pneumoniae is an important etiologic agent of tracheobronchitis and primary atypical pneumonia. It is responsible for 10%-30% of community acquired pneumonias overall. Because the organism grows slowly and is difficult to isolate from clinical specimens, culture is rarely undertaken in a routine context. In addition , Because M. pneumoniae lacks a cell wall, it does not respond to penicillins and other beta-lactams commonly used for the treatment of bacterial pneumonia.A reliable and sensitive serologic test for use in the early stages of M. pneumoniae infection is needed to confirm the clinical diagnosis and to ensure that the appropriate antibiotic therapy is used.P90 is a highly immunogenic protein in diagnosis and vaccine. In our research ,ORF6 gene was amplified by PCR from M. pneumoniae FH and a DNA fragment about 1003bp in length was obtained. The product was cloned into pMD18-T vector by TA clone. The recombinant plasmid was amplified by PCR again to get more ORF6 gene. The PCR product w