肺炎衣原体感染通过促进VE-钙粘素磷酸化增加内皮细胞通透性而诱导单核细胞跨内皮迁移-基础医学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得 的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或 机构送交论文，并编入有关数据库。 保密 ，在 年解密后适用本授权书。 本论文属于  不保密 √ 。 （请在以上方框内打“√” ） 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 导 师 签 名 ： 日期： 年 月 日 天津医科大学硕士学位论文 天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 目的： 利用肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae, C.pn）体外感染人脐静脉内皮细胞 系 Ea.hy926 细胞模型，观察 C.pn 感染对单核细胞跨内皮迁移的影响，并从血管 内皮细胞（Vascular endothelial cell, VEC）通透性角度探讨 C.pn 感染促进单核细 胞跨内皮迁移的机制，证实 C.pn 感染可通过促进血管内皮细胞钙粘素（Vascular endothelial cadherin, VE-cadherin）的酪氨酸磷酸化增加 VEC 的通透性，进而诱 导单核细胞跨内皮迁移。 方法： 1. 免疫荧光法鉴定人脐静脉内皮细胞系 Ea.hy926； 2. 利用 Percoll 非连续性密度梯度离心法分离人血液中的单核细胞；跨内皮迁 移实验观察 C.pn 感染对单核细胞跨内皮迁移的影响； 3. 跨内皮电阻（Transendothelial electrical resistance, TEER）实验检测 C.pn 感 染对 VEC 通透性的影响； 4. 免疫荧光法观察 C.pn 感染对 VE-cadherin 分布的影响； 5. 采用 Western blot 技术检测 C.pn 感染后 VEC 内 VE-cadherin 总蛋白及磷酸化 蛋白表达水平的变化； 6. 利用免疫共沉淀技术提取 Src 结合蛋白，液闪计数仪检测 C.pn 感染后 Src 激 酶活性的改变； 7. 用 Src 激酶选择性抑制剂 PP2 预处理 VEC 后，Western blot 检测 C.pn 感染 后 VE-cadherin 酪氨酸磷酸化水平的变化； 8. 用 PP2 预处理 VEC 后，免疫荧光法观察 C.pn 感染对 VE-cadherin 分布的影 响； 9. 用 PP2 预处理 VEC 后，利用 TEER 实验检测 C.pn 感染对 VEC 通透性的影 响； 10. PP2 预处理 VEC 后，跨内皮迁移实验观察 C.pn 感染对单核细胞跨内皮迁移 的影响。 I 结果： 1. Ⅷ因子免疫荧光染色鉴定 Ea.hy926 细胞系，结果显示，培养的 Ea.hy926 细 胞的胞浆呈绿色荧光，确定为 VEC； 2. 单核细胞跨内皮迁移实验结果显示，C.pn 感染 VEC 24 h 后，单核细胞跨内 皮迁移的数目明显多于正常对照组（P 0.05）； 3. TEER 实验结果显示，C.pn 感染 VEC 后，TEER 值呈时间依赖性下降；感染 后 12 h 至 24 h 下降速度加快，感染后 24 h 的 TEER 值明显低于正常对照组， 其差异有统计学意义（P 0.05）； 4. 共聚焦显微镜观察，正常对照组的 VE-cadherin 均匀分布于细胞与细胞连接 处，为连续不间断的状态；C.pn 感染 VEC 24 h 后，VE-cadherin 在胞膜上的 表达下降，而在胞浆分布增多，呈弥散分布，细胞与细胞连接处出现明显缝 隙； 5. Western blot 实验结果显示，C.pn 感染 VEC 后各个时间点的 VE-cadherin 总 蛋白表达水平与 0 h 比较无明显变化；而在感染 24 h 和 48 h 时，VE-cadherin （Y658）酪氨酸磷酸化水平均明显高于正常对照组（P 0.05），但感染后 24 h 和 48 h 之间的酪氨酸磷酸化水平无统计学差异； 6. 液闪计数仪检测结果显示，C.pn 感染 VEC 12 h 时 Src 激酶活性开始升高， 至感染后 24 h 达到峰值；随后开始下降，并持续至感染后 48 h。感染后各 时间点的 Src 激酶活性均高于正常对照组，差异有统计学意义（P 0.05）； 7. Weste