肺炎衣原体OmpA基因VD2-VD3区重组蛋白的表达、纯化及免疫活性研究-病原生物学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 4 得到以大小约为 450bp 的目的片段；构建的重组质粒经酶切鉴定和测序鉴定证明 其中插入片段为 OmpAVD2-VD3 目的基因，测序结果与 Genbank 上登录序列完全一 致；SDS分析显示，在 IPTG 诱导下，重组工程菌表达了一相对分子量（Mr） 约为 24 KDa 的目的蛋白条带，目的蛋白在菌体细胞内主要以包涵体形式存在； 经 Ni-NTA 亲和纯化获得了纯度在 95%以上的重组蛋白；Western-blot 检测其能 与 Cpn MOMP mAb 发生特异性反应；利用纯化的 MOMPVD2-VD3 重组蛋白免疫 BALB/c 小鼠，间接 ELISA 法测定鼠免疫血清特异性抗体效价在 1:20480 以上； 以重组蛋白为包被抗原建立间接 ELISA 法，检测标准血清参照品，灵敏度和特 异性均为 100%；对 50 份冠心病人血清进行检测，将重组蛋白间接 ELISA 法与 晶美公司 Cpn IgG ELISA 诊断试剂盒的检测结果进行比较，ELISA 法与诊断试 剂盒检测血清标本的符合率为 96%。 结 论： ⑴ 成功构建了原核表达体 pET30a-MOMPVD2-VD3，将其转化至大肠杆菌 BL21 后表达出了一相对分子量（Mr）约 24KDa 的重组蛋白； ⑵ MOMPVD2-VD3 重组蛋白具有较好的免疫原性，能刺激 BALB/c 鼠产生高 效价的特异性抗体； ⑶ MOMPVD2-VD3 重组蛋白具有良好的免疫反应性，能与 Cpn MOMP mAb 特异性结合，可应用于 Cpn 血清学诊断。 关键词：肺炎衣原体； 主要外膜蛋白； 基因表达； 蛋白纯化； 免疫活性 本课题受以下课题资助： 湖南省卫生厅重点课题资助项目（A03-006） Expression and purification of recombinant protein MOMPVD2-VD3 from Chlamydia pneumoniae and its immunocompetence analysis ABSTRACT Objective: To construct a recombinant vector containting the gene encoding immuno- dominant epitope of major outer membrane protein (Omp) of Chlamydia pneumoniae(Cpn), and to express and purify the recombinant protein, analyzing the immunoreactivity and immunogenicity of recombinant protein, to find a new antigen for the exploiting diagnosis of C.pneumoniae. Methods: The immunodominant epitope of OmpA gene was chosen by EXPASY analysis, then was amplified from C.pneumoniae complete genome by polymerase chain reactions (PCR), The PCR product was directly cloned into pUCm-T vector. After being identified by enzymes cleavage analysis and PCR, both the targeted gene and the prokaryotic vector pET30a were digested with BamHⅠ＋HindⅢ enzymes, and the digested products were linked together by ligase to reconstruct the pET30a-MOMPVD2-VD3 recombinant plasmid. After constructed the prokaryotic expression system, the recombinant plasmid was induced in E.coli BL21(DE3), and the positive recombinant was identified by enzyme cutting and PCR and sequencing. Recombinant protein MOMPVD2-VD3 was ex