肺炎衣原体Hsp10基因克隆与表达及诱生炎症因子和细胞凋亡作用的研究-病原生物学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 10 肺炎衣原体 Hsp10 基因克隆与表达及诱生炎症因子 和细胞凋亡作用的研究 硕士研究生：杨 玲 导 师：吴移谋 教授 中 文 摘 要 目的：PCR 扩增出肺炎衣原体（Cpn）热休克蛋白 10（Hsp10）基因，构建 重组质粒 pQE30/ Hsp10，在大肠杆菌（E.coli）中进行诱导表达，纯化获得重组 融合蛋白 rHsp10。研究该重组蛋白在体外诱导小鼠巨噬细胞表达并产生前炎症 细胞因子 TNF-α 和 IL-6 的水平及诱导细胞凋亡作用，为进一步探索 Cpn 感染致 病的分子机制提供试验依据。 方法：针对 Cpn Hsp10 基因设计引物，以 Cpn AR39 株基因组 DNA 为模板， PCR 扩增目的基因片段，将其插入 pUCm-T 载体，通过蓝白斑初筛，酶切分析、 PCR 及测序鉴定筛选阳性重组体；将 Hsp10 基因亚克隆至 pQE30 表达载体，构 建重组质粒 pQE30/ Hsp10，然后转化至宿主菌 M15 中进行诱导表达, 利用 SDS和 Western-Blot 进行分析和鉴定表达产物，Ni-NTA 亲和层析柱纯化 重组蛋白 rHsp10。用不同浓度的 rHsp10 刺激小鼠巨噬细胞 RAW264.7，ELISA 检测经刺激后的 RAW264.7 细胞产生的 TNF-α 和 IL-6 水平；以 RT-PCR 方法分 析 TNF-α 和 IL-6 mRNA 的表达。以 MTT 法检测经 rHsp10 处理后 RAW264.7 细 胞的增生或抑制作用，用 Hoechst33258 荧光染色、DNA 片段化分析、细胞凋亡 试剂盒检测经 rHsp10 处理后 RAW264.7 细胞的凋亡情况。 结果：PCR 成功扩增出 Cpn Hsp10 基因片段（309bp），构建了重组质粒 pQE30/Hsp10，并在 M15 菌中高效表达出 Mr 约为 15kDa 的 Hsp10 重组融合蛋白， 超声裂解后 SDS分析目的蛋白在菌体细胞内以可溶性形式表达，经 Ni-NTA 亲 和 层 析 柱 纯 化 获 得 纯 度 在 95% 以上 的 rHsp10 。 rHsp10 能诱导 RAW264.7 细胞表达 TNF-α 和 IL-6 的 mRNA，并以时间、剂量依赖方式刺激细 胞分泌前炎症细胞因子 TNF-α 和 IL-6，当 rHsp10 的浓度为 6μg/mL 时产生的 TNF-α 和 IL-6 量最多，分别为 12.67±0.66ng/mL 和 3.23±0.28ng/mL；当 rHsp10 刺激 RAW264.7 细胞 36h 时产生的 TNF-α 和 IL-6 量则达到高峰。另外，rHsp10 以剂量依赖方式抑制 RAW264.7 细胞增殖。当 20μg/mL rHsp10 处理 RAW264.7 细胞 24h 后，形态学上，细胞表现为皱缩、核碎裂、细胞起泡及凋亡小体等凋亡 特征；当 rHsp10 刺激 RAW264.7 细胞 6h 后，即可诱导其发生早期凋亡，12h 后 出现晚期凋亡；当 5μg/mL rHsp10 处理 RAW264.7 细胞 48h 后，即可检测到典型 的凋亡梯状带。 结论： 1、成功克隆 Cpn Hsp10 基因并构建了 pQE30/ Hsp10 原核表达载体，将其转 化 E.coli 后能高效表达出 Mr 约 15kDa 的重组融合蛋白； 2、Cpn 的 rHsp10 能诱导小鼠巨噬细胞 RAW264.7 表达并分泌前炎症细胞 因子 TNF-α 和 IL-6； 3、Cpn 的 rHsp10 既能抑制小鼠巨噬细胞 RAW264.7 增生，又能诱导其凋 亡。 关键词： 肺炎衣原体； 热休克蛋白 10； 巨噬细胞； 前炎症细胞因子； 凋亡 本课题受以下课题资助 湖南省卫生厅资助重点课题（A03-006） Cloning and expression of Chlamydia pneumoniae heat shock protein 10 gene and study of its induction of proinflammatory cytokines and apoptosis ABSTRACT Objective: In order to provide experimental basis for exploring pathogenic molecular machanism of Chlamydial pneumoniae (C. pneumoniae), C.pneumoniae heat shock protein 10 (Hsp10) gene was amplified by PCR technique to constr