葛根芩连汤含药血清及其主要代谢物对人肝癌huh7细胞株P38MAPK信号通路的作用及差异蛋白表达的研究-中药学专业论文.docxVIP

III III IV IV 目 录 摘要VI Abstract VIII 第一章 绪论1 1. 葛根芩连汤研究概述1 1.1 葛根芩连汤研究现状1 1.2.葛根芩连汤入血成分研究进展4 2.中药血清药理学概述5 HYPERLINK \l _TOC_250001 3.中药治疗肝癌的研究进展与 P38MAPK 简介 8 HYPERLINK \l _TOC_250000 4. 双向电泳（2-DE）概述 10 第二章 葛根芩连汤含药血清及其主要代谢物对人肝癌 huh7 细胞株 P38MAPK 信号通路的影响研究 12 1 仪器与试药14 1.1 仪器14 1.2 试药14 1.3 实验动物14 2 方法14 2.1 葛根芩连汤及给予药物的制备14 2.2 葛根芩连汤含药血清的制备15 2.3 细胞培养15 2.4 MTT 法确定各药物给药浓度 15 2.5 实时荧光定量 PCR 法检测 P38MAPK 通路各基因 mRNA 的表达 量 15 2.6 蛋白印迹法（western blot）检测 P38MAPK 蛋白表达情况 16 3.结果17 3.1 MTT 实验结果 17 3.2 荧光定量 PCR 结果分析 18 3.3 蛋白印迹法（western blot）检测结果 19 4.小结19 第三章 葛根芩连汤含药血清对人肝癌 huh7 细胞株蛋白表达谱的影响研究 21 1．仪器与试药22 1.1 仪器22 1.2 试药22 2.动物22 3.方法22 3.1 葛根芩连汤含药血清的制备与 huh7 细胞培养 22 3.2 双向电泳实验研究22 3.2.1 蛋白样品的制备22 3.2.2 样品溶液23 3.2.3 第一向等电聚焦23 3.2.4 第二向垂直电泳23 3.2.5 图像扫描与数据分析24 3.2.6 蛋白质鉴定和数据库检索24 4.结果24 4.1 样本浓度的测定24 4.2 蛋白质差异图谱25 4.3 质谱鉴定分析结果26 5、小结27 参考文献28 硕士期间发表学位论文32 致谢33 PAGE PAGE VII VI VI 葛根芩连汤含药血清及其主要代谢物对人肝癌 huh7 细胞株 P38MAPK 信号通路的作用及差异蛋白表达的 研究 摘要 肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）属于消化系统恶性肿瘤，肝癌患者的 死亡率在全球排第三位，每年可发生高达 700000 例的病例。发病原因大多是由 病毒性肝炎、酒精或肝毒物质引起。对于肝癌的治疗，临床上一般以手术切除 和化疗作为主要手段，但是目前使用的化疗药物不良反应大、选择性差、易引 起耐药性，因此，选取中药对肝癌进行治疗的优势日益突出，目前，已有大量 关于中药治疗肝癌的研究，并且许多中药活性成分已经被证实具有治疗肝癌的 药理活性。 葛根芩连汤来源于汉·张仲景《伤寒论》，处方由葛根、甘草、黄芩和黄连 四味药组成，是中医药配伍精华理论的名方之一。中药复方成分多，作用靶点 多，经吸收入血生物转化后，产生疗效的可能是存在于复方中的药物原型，也 可能是复方代谢产物或新物质。基于中药复方的特点，对中药复方药效的研究 不应该只局限于研究复方整体的作用，或只研究复方中单一成分及含量较高的 成分，应当充分考虑中药复方的药代动力学特点，选取中药复方含药血清与主 要代谢入血成分作为对象进行研究，并结合体内外实验及血清药理等方法，从 复方含药血清与主要代谢物入手，可以更充分有效地阐明中药复方的作用机理。 目前对于葛根芩连汤的大多数研究都只限于整方及主要单体的质量控制及药效 作用研究，而主要单体成分不一定是最好的药效活性成分，基于对葛根芩连汤 整方及代谢成分药效作用的相关研究较少，本研究将以此对葛根芩连汤进行更 深入、更详尽地开发研究，此外，本研究方法也为复方的研究及新化合物作为 先导药物提供了新的思路。 本研究利用 MTT 比色法、实时荧光定量 PCR 法和 western blot 法研究葛根 芩连汤含药血清及其主要代谢物对 huh7 肝癌细胞株 P38MAPK 信号通路的影响 和相互关系。首先通过 MTT 法确定含药血清组及各代谢物组给药浓度，再用 荧光定量 PCR 法检测 huh7 细胞 P38MAPK 信号通路中各基因 mRNA 转录水平； Western blot 法检测 huh7 细胞 P38MAPK 信号通路中各蛋白的表达情况。蛋白 质凝胶电泳结果表示，葛根芩连汤含药血清组对 P38、JNK 的表达有上调作用， 对 ERK 的表达有下调作用；葛根素对 ERK 的表达有下调作用，对 JNK 的表达 有上调作用；大豆苷对 P38、JNK 的表达有上调作用；大豆苷苷元对 P38 的表 达有上调作用(P0.05)。通