肝细胞生长因子质粒的建立及其在成纤维细胞的表达与鉴定-微生物与生化药学专业论文.docxVIP

中文摘要 目的t 构建含人的肝细胞生长因子 (Hmnanhe阴阳yte growth facωr) 基因真核 表达载体 pEGFPNI-HGF ，探讨其在体外培养人的成纤维细胞的转染与表达，为 其在体内应用提供实验依据。 方法: 阳:PCR 扩增人的间充质干细胞中hH GF 全长 cDNA 片段，克隆入 pEGF弘Nl 真核表达载体中，报得 pEGFP-NI-HGF 重 组质粒。应用脂质体技术以绿色荧光蛋白 (GFP) 作为报告基因，采用脂质体 地 ‘飞 Lipofectamine 2000 包裹 pEGFP-NI-HGF 重组质粒转染到人的皮肤成纤维细胞 中，研究了细胞接种密度、 DNA 用最、脂质体与 DNA 的比例等因素对脂质体转 唱 染效率的影响，获得表达克降。采用荧光显微镜观察、逆转录聚合酶链反应 (阳:PCR)、蛋白质印记方法CWestem Bhtting) 鉴定和皿ISA 方法定性和定量 的测定hHGF 的表达。 结果: 1.质粒酶切鉴定结果:提取的质粒经双酶切、 琼脂糖凝胶电泳鉴定后可得到 4660bp 和 2200bp 两个片段，与原质粒图谱符合， 表明所提取的质粒为重组 pEGFP- N1- HGF 0 2. 人的皮肤成纤维细胞经 2-5 次传 代后转染重组质粒 p巴GFP- N1- HGF 后，荧光显微镜下观察到细胞内发出绿色荧 光，在细胞接种密度为和 10、 0.8咱DNA 用盘、 2.5: 1 的脂质体与 DNA 比例时， 转染效率最高分别为 22.73士0.44%、21.88士0.34%、22.29土0.42%. 3. 转染后细胞 提取总 RNA 后经过Rf-PCR 能扩增 HGF cDNA 预期的 756bp 片段，证实转染 质粒在成纤维细胞内有转录， We阳m bt例ting 证实转染 HGF 基因在成纤维细胞 内有 HGF 蛋白的表达，间时通过 EUSA 法检测转染细胞的上清液，表明转染成 纤维细胞中有分泌，其分泌最为 (5.97.55 t嗨/ 8X 105ωlls)。结论: 成功构建 重组质粒 pEGFP-NI-HGF ，并证实其能够在成纤维细胞中转录与表达分泌，揭示 我们构建的成纤维细胞模型能够替代毛乳头细胞分泌肝细胞生长因子的功能，为 脱发疾病的基因泊疗提供依据。 喝战 町 关键调z 脂质体肝细胞生长因子基因成纤维细胞基因转染 咱 ABSTRACT Objωtive: To ωnstruct a p lasmid carrying human he阴阳仰 gro帆h fàc伽(hHGF) gene and de能:rmine t he e能:cts of the hepa:ωc抖e growth fàcωr 但GF) geneo n transfection and expression of human fibroblast cells in vitro. Methods: 白le full lel唱thcDNAof 趾fGF，which was atqlified from human mesenchymalstemcells mRNA by RT-PC民 was cloned into pEGFP-Nl vecωrωconstruct pEGFP-NI-HGF 电 mω幽inantp lasmid. Wi由Lipofèctamine 2000 liposor册， the recombinant p lasmid ‘ p巴GFP-NI-HGF w.掘出伽 t18nsrectt he c ulture human fibrob last c el1sA伽 咱 pEGFP-NI-HGF transfectio n， the 岛llowing transrectin conditions were op timized: cell density，DNAa momt， 18ti of líJX ωllle and DNA. The t ransrectíma 时 eXJressin ofH GF i nhum anfibroblast cells were tested by 邸PCR and Western Bbtting， the velo fsec阳ted HGF P rotein in s 叩ernatant was d etermined w 批h en却me斗mked immW1oso巾ent assay (ELISA). Result: 1.Two DNA segllle?饵， about 4.7kb and 2.2kb in ngth， were obtained a如r digest