低剂量辐射及CD44单克隆抗体IM7对慢性髓细胞白血病干祖细胞辐射敏感性及归巢影响的实验研究-内科血液学专业论文.docx

低剂量辐射及 低剂量辐射及 CD44 单克隆抗体 IM7 对慢性髓细胞白血病干祖细胞辐射敏感性及归巢影响的实验研究 中文摘要 中文摘要低剂量辐射及 中文摘要 低剂量辐射及 CD44 单克隆抗体 IM7 对慢性髓细胞白血病干祖细胞辐射敏感性及归巢影响的实验研究 I I PAGE PAGE IV 低剂量辐射及 CD44 单克隆抗体 IM7 对慢性髓细胞 白血病干祖细胞辐射敏感性及归巢影响的实验研究 中文摘要 目的和意义 现有的研究结果表明，白血病干细胞（Leukemic stem cells，LSCs）是白血病发 生、维持的基础，其 95%以上的细胞处于 G0 期，对常规的放、化疗多不敏感，成为 白血病治疗后残留与复发的根源，因此白血病干细胞的根除是治疗成功的关键。 目前针对 LSCs 的靶向治疗很多，但单一治疗效果不太理想，因此有必要从多途 径、多种治疗手段联合应用方面深入研究与探讨，以提高靶向治疗的疗效。近年来， 有研究证实白血病干细胞必须归巢及植入骨髓才能发挥其生物学特性。因此，人们就 试图通过特异性干扰 LSCs 细胞的归巢、植入，从而改变 LSCs 的命运。其中，细胞 表面黏附分子 CD44 与多种恶性肿瘤发生、转化相关，因此受到研究者的关注。Krause 等研究证实了表达 BCR-ABL 融合基因的 LSCs 归巢和植入骨髓需要 CD44 分子的参 与。 LSCs 细胞多处于休眠期，对常规照射剂量抗拒，非常规照射剂量成为研究热点。 低剂量照射（Low dose irradiation，LDR）因其具有免疫增强效应、超敏感性、抗肿 瘤效应等倍受关注。但 LDR 的超敏感性，能否有效地杀灭化疗后残存的 LSCs 细胞； 其免疫增强效应能否有效地放大 GVL 效应以清除 LSCs 细胞等，目前未见报道。 基于上述的研究现状以及我们的设想与推测，本实验以表达 BCR-ABL 融合基因 的 LSCs 细胞归巢和植入过程需要 CD44 分子的参与，以及 LDR 的免疫增强效应、超 敏感性及抗肿瘤作用为切入点，研究抗 CD44 单克隆抗体 LDR、 IM7 单独或联合对 人 CML- LSCs 细胞辐射敏感性及归巢的影响。研究目的在于为靶向治疗人 CML 干 祖细胞提供新的治疗策略与思路，并拓宽放射治疗技术在白血病治疗中的应用。 方法 第一部分 取 20 例健康产妇脐血 100ml，免疫磁珠法分离纯化脐血 CD34+干祖 细胞作为对照组；取 40 例初诊慢性髓细胞白血病慢性期患者骨髓液 5-10ml，免疫磁 珠法分离纯化白血病 CD34+干祖细胞作为实验组，克隆形成分析法测定两种细胞的存 活分数，采用多靶单击模型和线性二次模型拟合细胞存活曲线，根据 D0、Dq 及 α／β 比值等放射生物学参数，比较两种细胞的放射敏感性。流式细胞仪检测两种细胞周期 时相分布的差异性。 第二部分 将上述两种免疫磁珠法分离纯化的 CD34+细胞依据 LDR 剂量 0cGy、 12.5 cGy 和 50cGy 分组，辐照后分别于 24、48 和 72h 收集细胞，流式细胞仪检测 LDR 对两种干祖细胞的细胞周期分布及凋亡率的影响；另于辐照后 24h 收集细胞应用 Western Blotting 检测 CML-CD34+细胞 P53 蛋白的表达变化；RT-PCR、RQ-PCR 检测 两种细胞中 P16、DAPK1 基因 mRNA 表达的变化。 第三部分 将上述两种免疫磁珠法分离纯化的 CD34+细胞与 CD44 单克隆抗体 IM7 孵育后，首先应用流式细胞仪检测 CML-CD34+细胞和脐血 CD34+细胞 CD44 分 子表达情况，再利用 MTT 法检测 IM7 孵育前后两种干祖细胞与血管内皮细胞黏附能 力的变化，Transwell 实验检测其迁移能力的改变。 第四部分 取 20 例初诊的慢性髓细胞白血病慢性期患者的 CML-CD34+细胞，利 用 Annexin-V 试剂盒检测 CD44 单克隆抗体 IM7 对 CML-CD34+细胞凋亡的影响； RQ-PCR 及 RT-PCR 检测 CML-LSCs 中原癌基因 C-myc、NF-κB 表达状况；Western-blot 检测 IM7 孵育后 CML-CD34+细胞中 Bcl-2 蛋白表达的变化。 结 果 第一部分 （1） 脐血 CD34+细胞和 CML-CD34+细胞对射线均较敏感，呈现良 好的剂量效应关系；（2）多靶单击模型中，脐血 CD34+细胞的 SF2、D0、Dq 值分别 为 0.3508、2.247、0.083，CML-CD34+细胞的 SF2、D0、Dq 值分别为 0.2972、1.828、 0.037；（3）线性二次模型中，脐血 CD34+细胞和 CML-CD34+细胞的 α／