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高羊茅ESTSSR标记开发及品种鉴定 　　摘要：利用EST-SSR分子标记对11份高羊茅(Festuca arundinacea)材料进行了品种鉴定研究。在优化DNA提取方法、扩增体系的基础上对50对EST-SSR引物进行筛选，结果表明：有42对引物可以在高羊茅上得到有效扩增，对11份高羊茅品种的鉴定结果表明，其中12对引物具有良好的多态性，占28.6％；共检测到86个等位基因，平均每个位点的等位基因数为4.5个，变幅为3-12。从谱带类型上看：S3和S44引物扩增的谱带类型最少(2种)，多态性百分率最低，为18.2％；S11引物扩增的谱带类型最多(9种)，多态性百分率最高，为81.8％；共扩增到多态性谱带65种，平均多态百分率为59.1％。 　　关键词：高羊茅；品种鉴定；EST-SSR 　　中图分类号：Q789；S688.403.7　文献标识号：A　文章编号：1001-4942(2010)10-O007-04 　　 　　高羊茅(Festuca arundinacea)别名苇状羊茅，属禾本科(P0aceao)早熟禾亚科(Pooideae)早熟禾族(Poeae)羊茅属内的Boyinae亚属，是温带地区广泛种植的六倍体多年生草坪草。作为耐热的冷季型草坪草，不但能忍受冬季低温，而且也能在一定程度上忍受夏季的高温而不至于枯黄，因此适合在我国大部分地区生长，近年来已成为我国主要的草坪草之一。 　　我国高羊茅种子主要依靠进口。一些不法种子经营者唯利是图，以劣质高羊茅种子充斥市场，给生产造成极大的损失，生产者、经营者对高羊茅纯度检验的要求日益迫切。由于高羊茅是多倍体作物，其异花授粉和自交不亲和性限制了经典遗传学研究的深入开展，分子标记是解开这道难题的便利途径。 　　目前已经开展的高羊茅分子标记研究包括：由Southern杂交衍生的RFLPs标记(Re-striction Fragment Length Polymorphisms，限制性片段长度多态性)和基于PCR扩增的标记，包括RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)、AFLP(Amplified FragmentsLength Polymorphism，扩增片段长度多态性)、SSR(Simple Sequence Repeats，简单重复序列，又称微卫星DNA)及ISSR(Inter-simple Sequence Re-peats，即简单重复序列间扩增，或锚定SSR)等，另外PCR和RFLP结合的PCR-RFLP也已经得到应用。这些研究主要应用在遗传图谱构建、比较基因组作图、系统分类亲缘关系的研究、遗传多样性的分析和利用品种指纹图谱进行杂种鉴定。而利用EST-SSR进行高羊茅品种鉴定尚未见报道。本研究拟对11个优良高羊茅品种的遗传多样性进行SSR分析，以期为高羊茅快速品种鉴定技术提供理论依据。 　　 　　1、材料与方法 　　 　　1.1　材料 　　试验材料：从山东各地市场搜集的主栽高羊茅品种11份，分别是：Amigo、Alamo、Quest、Re-ward、王朝、凌志、维加斯、金王月、翠碧、南方选择、爆炸组合。 　　引物序列：来自文献中EST-SSR，利用DNAman软件进行重新设计，设计原则如下：SSR序列的开始和结束位置分别距5?@和3?@端不少于20bp；引物长度19-24bp；退火温度Tm值50-67℃。且上游和下游引物的Tm值相差不大于5℃；(G+C)含量30％-70％；PCR扩增产物长度100-600bp；尽量避免引物二级结构和寡二聚体的出现。最后筛选到50对引物交付上海生工生物技术服务有限公司合成。PCR所用的Mg2+、Taq酶、dNTP、Buffer均购自上海生工生物技术服务有限公司。 　　1.2　方法 　　1.2.1　基因组DNA提取高羊茅是一种常异花授粉植物。根据预备试验单株幼苗的提取效果和文献报道得出的有代表性的取样量，每品种随机选取30个生长良好的发芽7天后的单株幼嫩叶片等量混合，采用改良CTAB法和Tiangen试剂盒法提取DNA并进行比较试验。 　　利用1％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度，样品于4℃冰箱保存备用。 　　1.2.2　PCR反应体系的建立及优化 　　对Mg2+浓度、dNTP、引物浓度、Taq酶浓度进行4因素3水平的正交试验，并在BIOMETRA TGRADIENT梯度PCR仪上进行引物最佳复性温度的筛选。最适合于高羊茅SSR分析的20μl优化反应体系为：模板10ng/μl，dNTP 240μmol/L，引物浓度0.4μmol/L，Taq酶1.0 U，Mg2+2.5mmol/L。PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30