高产L精氨酸的钝齿棒杆菌在不同供氧条件的差异蛋白质组学研究-发酵工程专业论文.docxVIP

摘费 摘要 i 111111111111111 111 111 IIIOO IIllllll 11 I Y1889518 L精氨酸(L-Arginine ，LArg)作为…种条件性必需碱性氨基酸，是百肌强同圳、脚 酸肌酸的竟要原料，也是生物体内尿素循环的重要中间产物，对生物体维持 i在常的生理 功能有重要作用。因此， 精氨酸在食品、化妆品、临床医药等领域有广泛应用，市场 需求量不断增加。 本论文所用菌株钝齿棒杆菌 Corynebαcterium crenatum SYPA5-5 为本实脆案保娥的 …株L精氨酸高产菌株。前期研究表明已 C陀natum SYPA5-5 为好氧菌株，且供氧水平 对菌体生长及 L柑氨酸的合成均具有极其重要的影响，氧的供应不足不仅会抑制菌体生 长，还会严重抑制 L精氨酸的合成。满足菌体高的氧需求通常有两种方法:一是提高发 酵过程中发酵液的溶解氧水平，另一途径则是利用基因工程手段来提高菌体自身对氧气 的利用效率。 本文分别跑过在摇瓶发酵中设定不同的装液量及在 5L 自控发酵罐分批发酵中设定 不问转速的方法，建立了两类供氧差异模型，并测定了不同供氧条件下的C. crenatum SYPA5-5 的发酵特性。 在发酵过程中，通过双向电泳 (2-DE) 、质谱鉴定及数据库检索等技术，对不同供氧 条件下巳 crenatum SYPA5-5 胞内可溶性蛋白进行差异分析。在不同时期，不同供氧条 件下，共鉴定了 109 个差异蛋白，包括与碳源代谢、氨基酸代谢、能量代谢、翻译相关、 次级代谢相关的蛋白及一些未知功能的蛋白。通过代谢途径分析发现:这些差异蛋白主 要集中在 HMP 途径、 TCA 循环及尿素循邱。高供氧 (HOS)条件下，这些途径都有所增 强，尤其是 HMP 途径，这与本实验室前期的代谢流最分析结果一致。 由于 HMP 途径不仅调控着葡萄糖代谢的流向，还为细胞提供 NADPH. 因此 HMP 途径的增强为细胞提供了更多的 NADPH ，不仅为细胞提供还原力，缓解氧毒性，还作 为精氨酸合成途径中 N- 乙毗千谷氮酌磷酸还原酶的辅酶催化 L-精氨酸的合成。 NAD 激 酶可将胞内 NAD(H) 转变为 NADP(H) 。因此，本论文成功构建了携带有NAD 激酶基因 ppnK 的表达质粒 pJCl 翩tac-ppnK ，井分别转入 E.coli JM lO仰9 和巳 C附阳nαωω阳tμum SYPA5-5o 对 童组菌株巳 旷Crenαωtz1叫mn叫1叫邸p(巾JC口1幽.耐- 养基重组菌 c.c.(p兀JClμ-tlαc-ppnK)??L-精氮酸产最可达 5位2.25 gL-斗1 ，较出发菌株(45.17 gL-) 提高了 15.66%。重组菌株的糖酸转化率(YP/S ) 的由 33.48%提高到了 36.62% 。 关键词: L-精氨酸，钝齿棒打酶，供氧策略，蛋白质组学， NAD 激酶  Abstract Abstract L-Arginine，a substantial intermediate metabolite in omithine cycle，is one kind of semi-dispensable amino acids. It is also a critical material in the process of protein and creatine phosphate synthesis，and has significant effect in maintaining normal physiologic function in organism. Therefore ，L-arginine has numerous applications in pharmaceuticals ， food f1avor and cosmetics. 咀le stain Corynebacterium crenatum SYPA5-5，researched in this thesis is an L-arginine hyper-producing mutant strain stored in our lab. Preliminary study showed that C.crenatum SYPA5-5 wωan aerobic bacterium ，that inadequately supplying of oxygen not only ínhíbited cell growth，but also severely inhib