高表达 P2X7受体抑制宫颈癌Caski 细胞生长的实验研究-免疫学专业论文.docxVIP

三 峡 大 学 硕 士 学 位 论 文 I 三峡大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作 所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经 发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明 确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 学位论文作者签名： 日 期： 三峡大学研究生知识产权承诺书 本人承认：我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究 工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。 本人承诺：我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部 或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊 发学术论文、进行成果鉴定或申报奖励，均以??峡大学为第一作者单位或完成单位， 并事先征得导师或学校相关部门的同意。 我愿承担因违背上述承诺而引起的一切法津和经济后果。 学位论文作者签名： 日 期： II 内 容 摘 要 目的：检测宫颈癌 Caski 细胞表面是否表达有功能的 P2X7 受体；探讨在 Caski 细胞上稳定高表达 P2X7 受体后对细胞生长的影响；进一步探讨外源性三磷酸腺苷 （ATP）对高表达 P2X7 受体的 Caski 细胞的生长影响。 方法：(1) 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞术(FCM)、免疫组化技 术检测宫颈癌上P2X7受体的表达。(2)将质粒pcDNA6/V5-His-P2X7转染至Caski细胞， 用RT-PCR、Western blotting、细胞免疫荧光等方法检测P2X7受体在真核细胞内的表 达及定位，为检测高表达P2X7受体对细胞生长的影响用MTT法检测细胞增殖。(3) 进 一步检测P2X7受体的天然配体ATP处理后对高表达细胞生长的影响，用MTT检测细 胞生存率，荧光染色法检测线粒体膜电位的变化，FCM检测细胞凋亡率以及Western blotting分析凋亡相关蛋白的变化。 结果：(1) RT-PCR、FCM、免疫组化结果表明在宫颈癌Caski细胞上P2X7受体的 表达减少。(2) 稳定细胞株的建立：通过抗性筛选获得稳定表达P2X7的Caski细胞株 (Caski/P2X7)和阴性对照细胞株(Caski/3.1)。RT-PCR结果显示转染质粒 pcDNA6/V5-His-P2X7 的Caski细胞出现约180bp条带，阴性对照细胞株(Caski/3.1)无 条带出现；Western blotting检测转染质粒pcDNA6/V5-His-P2X7 的Caski细胞出现约 75KDa的目的条带；荧光显微镜下观察结果显示在Caski细胞膜上有红色荧光，表明 有P2X7的蛋白表达，而阴性对照细胞未见荧光。MTT分析高表达P2X7受体后可抑制 Caski细胞增殖。(3) 用ATP处理Caski/P2X7和Caski/3.1细胞后，与对照细胞Caski/3.1 比较，ATP处理后抑制Caski/P2X7细胞增殖较明显(*,p0.05)；随着ATP浓度的增加 FCM结果显示Caski/P2X7细胞凋亡率逐渐增加及线粒体膜电位逐渐降低；Western blotting检测结果显示Caski/P2X7细胞胞质细胞色素C的含量增多另外抗凋亡蛋白Bcl2 减少促凋亡蛋白Bax增加。 结论：成功获得稳定高表达P2X7受体的宫颈癌Caski细胞株，并且用ATP作用细 胞后可抑制细胞增殖，并诱导细胞凋亡，本研究结果提示P2X7可作为肿瘤治疗和预 防的潜在靶点。 关键词：P2X7受体 宫颈癌Caski 细胞凋亡 ATP  PAGE 3 Abstract Objective To test the expression of P2X7 receptor in cervical cancer, high expression of P2X7 receptor on cell growth and further analyze the effects of exogenous adenosine triphosphate (ATP) on Caski cell growth with high expression of P2X7 receptor. Methods (1) Analysis of P2X7 receptor expression by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR), flow cytometry(FCM) and immunohistochemical in cervical cancer. (2) T