《生物化学与分子生物学》基因诊断与基因治疗.ppt

一、基因治疗的策略 （一）基因置换（gene replacement） 定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，导入的正常基因，以置换基因组内原有的缺陷基因。 目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。 对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。 定向整合的条件:转导基因的载体与基因组DNA具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列的交换。 基因同源重组技术又称为基因打靶(gene targeting） 细胞内基因同源重组的发生率很低。 基因同源重组技术 （二） 基因添加（gene augmentation） 定义: 通过导入外源基因使靶细胞表达其本身 不表达的基因。 类型: 在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能； 向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。 （三）基因干预（gene interference） 定义： 采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。 定义：将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。 应用：是恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。 （四）自杀基因治疗(Suicide Gene Therapy) 自杀基因的作用机制 ?TK/GCV 单纯疱疹病毒（herps simplex virus, HSV）Ⅰ型胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因编码胸苷激酶，特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷（ganciclovir, GCV）转变成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，导致细胞死亡。 1.自杀基因系统 定义: “自杀基因”导入后，不仅使转导了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。 2. 旁观者效应（bystander effect） （五）基因免疫治疗 通过将抗癌免疫增强的细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。 二、基因转移技术 基因治疗的两种途径 载体 目的基因 in vivo ex vivo 靶细胞 目 录 基因转移(gene transfer)技术 1.病毒介导的基因转移 2.非病毒介导的基因转移 1.病毒介导的基因转移系统 病毒载体介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有72%的临床实验计划和71%的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是反转录病毒载体。 反转录病毒的结构及生活周期 （1）反转录病毒 两端各有一长末端重复序列LTR。 反转录病毒前病毒的结构特点 LTR由U3、R和U5三部分组成。 病毒有三个结构基因 5ˊ端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列（ψ）及剪接供体位点(SD)和剪接受体位点(SA)。 含有负链DNA转录的引物结合位点(PBS)和正链DNA转录的引物结合位点。 在U3内有增强子和启动子； U3和U5两端分别有病毒整合序列(IS) ； 在R内还有poly(A)加尾信号。 gag基因，编码核心蛋白和属特异性抗原； pol基因，编码反转录酶； env基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。 反转录病毒介导的基因转移系统 ——由两部分组成 反转录病毒载体：其基因组为缺陷型，保留了病毒的包装信号ψ，而缺失病毒的包装蛋白基因；它可以克隆并表达外源治疗基因，但不能自我包装成有增殖能力的病毒颗粒。 辅助细胞株(如PA317)：由另一种缺陷型反转录病毒（即带有全套病毒包装蛋白基因，但缺失包装信号ψ的反转录病毒）感染构建而成。能合成包装蛋白，用于反转录病毒载体包装，但本身却不能包装成辅助病毒颗粒。 Retroviral packaging system 反转录病毒载体的特点 ①反转录病毒包膜上env编码的糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使反转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。 ②反转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响其他部分的活性。 ③前病毒通过LTR高效整合至靶细胞基因组中