NY/T 681-2003鸡传染性贫血诊断技术.pdf

NY/T681-2003 前 言 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由农业部畜牧兽医局提出并归口。 本标准起草单位:农业部兽医诊断中心。 本标准主要起草人:王宏伟、吴清民、田克恭、陈西钊、苏敬良、王传彬。 NY/T681-2003 鸡 传 染 性贫 血 诊 断技 术 范围 本标准规定了鸡传染性贫血(CIA)的临床诊断、CIA病毒的分离与鉴定、酶联免疫吸附试验和免疫 酶试验等诊断技术。 本标准适用于CIA的诊断。 1右床诊断 2.1 临床症状 2.1.1CIA的主要临床特征是贫血。病鸡表现精神萎靡、虚弱、聚堆及行动迟缓，羽毛粗乱，嚎、肉髯、 面部和可视勃膜苍白，羽部有出血病灶，生长不良，排白稀粪。 2.1.2 产蛋种鸡感染无临床症状，产蛋率、受精率和孵化率均不受影响，但可通过种蛋传播病毒。 2.1.3 当有马立克氏病、传染性法氏囊病等免疫抑制性疾病发生时，雏鸡对鸡传染性贫血病毒 (CIAV)的易感性增高，发病早且严重。 2.2 病理变化 2.2.1病鸡表现再生障碍性贫血，消瘦，骨髓发白，肌肉及内脏器官苍白，肝脏、肾脏肿大并褪色，血液 稀薄，凝血时间延长。 2.2.2 病鸡表现全身性淋巴组织萎缩，胸腺、法氏囊、脾脏和盲肠、扁桃体以及其他组织内淋巴细胞严 重缺失。 病毒分离与鉴定 3.1 材料准备 3.1.1 试荆 a) 改良最低要素营养液(DMEM)培养基，配方见第A.1章; b) 马立克氏病病毒转化的淋巴细胞系MDCC-MSB1细胞; c) 标准阳性血清:用CIAV抗原免疫SPF鸡获得的血清; d) 标准阴性血清:无CIAV感染的SPF鸡血清; e) 新生牛血清、青霉素、链霉素。 3.1.2 器材 a) 细胞培养瓶; b) 吸管; c)二氧化碳培养箱; d) 37℃恒温水浴箱; e) 普通冰箱及低温冰箱; f) 离心机及离心管; 9)研磨器械; h) 普通光学显微镜; i)微量加样器，容量5pL-50pL,50pL-200.IL; j) 0.45ym微孔滤膜。 3.1.3 样品 NY/T681-2003 CIAV存在于病鸡肝脏、皮肤、脾脏、心脏、胸腺、肺脏、法氏囊、肾脏、骨髓等组织器官中。无菌采集 这些器官，用无血清DMEM制成20%组织悬液，以3000r/min离心30min。取上清70℃下处理 5min后加等量10%三氯甲烷室温处理15min，以10000r/min离心20min，取上清用于CIAV分离。 32 操作方法 321 细胞培养 用含15`a新生牛血清的DMEM培养基在”℃和5%二氧化碳环境下培养MDCC-M561细胞。每 2d^-3d传代一次 细胞长至2X10个/mL5X105个/mL时，用于CIAV分离 3.2.2 病料接种 将。.1mL处理好的组织悬液接种MDCC-MSB1细胞，在39℃和5%二氧化碳环境下培养4sh，观 察结果。 3.2.3 结果观察 CIAV感染细胞表现为细抱体积增大，随之溶解，若第一次接种未出现纫胞病变，应将细Jit培养物 冻融后盲传三代 如仍无细胞病变，则判为CIAV检测阴性。 3.2.4 CIAV的鉴定 将出现细胞病变的细胞培养物，按第5章的方法制备细胞涂片，用CIAV标准阳性血清进行鉴定。 4 酶联免疫吸附试验 口一1材料准备 一‘Il试剂 a)ELISA抗原:CIAV抗原包被酶标板; U) 阳性血清:用CIAV抗原免疫SPF鸡获得的血清; c) 阴性血清:无CIAV感染的SPF鸡血清; d)酶结合物:辣根过氧化物酶HRP标记抗CIAV单克隆筑体; e)磷酸盐缓冲液(PBS):配制见第AZ章; f} 洗潦液 配制见第A.3章、 g) 样品稀释液 配制见第A.4章 h) 底物溶液 cz制见第A.6章; ，) 终止液:配制见第A.7章。 4.1.2 器材 a) 酶联检测仪: b) 微量加样91，容