NY/T 684-2003犬瘟热诊断技术.pdf

ICS 11.220 8 41 中华 人 民共 和 国农 业 行 业 标 准 NYJT684-2003 犬 瘟 热 诊 断 技 术 Diagnostictechniquesforcaninedistemper 2003-07-30发布 2003-10-01实施 中华人民共和国农业部 发 布 NY/T684-2003 月吐 青 本标准的附录A为规范性附录 本标准由农业部畜牧兽医局提出并归口。 本标准起草单位:农业部兽医诊断中心 本标准主要起草人:田克恭、王宏伟、遇秀玲、陈西钊、王传彬。 NY/T684-2003 犬 瘟 热 诊 断 技 术 1 范围 本标准规定了犬瘟热(CD)的临床诊断、犬瘟热病毒(CDV)的分离与鉴定、免疫酶试验和免疫酶组 织化学方法等诊断技术 本标准适用于犬瘟热的诊断 2 临床诊断要点 2.1 临床症状 CD的临床表现多种多样，与CDV的毒力，环境条件，宿主的年龄、品种及免疫状态有关。病犬体 温升高至40℃以上，鼻流清涕至脓性鼻汁，脓性眼屎，有咳嗽、呼吸急促等肺炎症状，腹下可见米粒大丘 疹。病程长的犬足枕角质层增生。病后期CDV侵害大脑时则出现神经症状，头、颈、四肢抽搐。 2.2 病理变化 CDV为泛嗜性病毒，对上皮细胞有特殊的亲和力，因此病变分布非常广泛。新生幼犬感染CDV通 常表现胸腺萎缩。成年犬多表现结膜炎、弃炎、气管支气管炎和卡他性肠炎。表现神经症状的犬通常可 见鼻和脚垫的皮肤角化病。中枢神经系统的大体病变包括脑膜充血，脑室扩张和因脑水肿所致的脑脊 液增加。 CDV的包涵体通常呈嗜酸性，位于胞浆内，直径1t}m-5km，可在粘膜上皮细胞、网状细胞、白细 胞、神经胶质细胞和神经元中发现。核内包涵体多位于被覆上皮细胞、腺上皮细胞和神经节细胞。 3 病毒分离与鉴定 3.飞 材料准备 3.1.1试剂 3.1.1.1改良最低要素营养液(DMEM)培养基，配方见第A.1章。 3.1.1.2 非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)。 3.1.1.3 标准阳性血清:CDV单克隆抗体，中和抗体效价 1，1024. 3.1.1.4 标准阴性血清:无CDV感染的犬血清。 3.1.1.5 新生牛血清处理:用无血清DMEM洗涤细胞两次，加人培养液二分之一量的新生牛血清 37℃吸附1h。吸附后的新生牛血清分装，置一20℃备用 3.1.1.6 青霉素、链霉素。 3.1.2 器材 a) 细胞培养瓶; 卜) 吸管; c) 二氧化碳培养箱; d) 370C恒温水浴箱; e)普通冰箱及低温冰箱; f) 离心机及离心管; 9) 研磨器械; h) 普通光学显微镜; NY/T684-2003 i) 微量加样器，容量5,11^-50,11,50,1L-V200,1l; j) 0.45,1m微孔滤膜。 3.1.3 样品 CDV存在于病犬心脏、肺脏、脾脏、胸腺、淋巴结等组织器官中。无菌采集这些器官用无血清 DMEM制成20%组织悬液，3OOOr/min离心30min，取上清。10000r/min离心20min，取上清用于 CDV分离。 3.2 操作方法 3.2.1 细胞培养 用含8%已处理的新生牛血清的DMEM培养基，在37℃培养Ver。细胞。每3d-4d传代一次， 细胞长成单层时，用于CDV分离 3.2.2 病料接种 将。.1m工处理好的组织悬液接种Ver。细胞，33℃吸附1h，加人无血清DMEM继续培养5d- 7d，观察结果 3.2.3 结果观察 CDV感染Vero细胞4d-5d表现为细胞变圆、胞浆内颗粒变性